ANTIBIYOTIKLERIN BAKTERISIDAL ETKILERININ BELIRLENMESI
Infeksiyon hastalıklarının tedavisinde antibiyotiklerin kullanılmaya baslamasıyla yeni bir çıgır açılmıs ve geçmis yüzyıllarda en önemli ölüm nedeni olan infeksiyon hastalıklarını bu sıralamada daha gerilere itmistir. Tedavide kullanılan antibiyotiklerin bir kısmının etkisi, yalnızca bakterilerin çogalmasını durdurmakla sınırlı kalmakta, antibiyotik baskısı kalktıgında bu etki de ortadan kalkmakta ve bakteriler çogalmalarına devam etmektedir.
Antibiyotiklerin bu etkilerine “bakteriyostatik etki” denir. Makrolid grubu antibiyotikler ve kloramfenikol bu tip etki göstermektedirler. Ilk kullanılan antibiyotik olan penisilinin de içinde yer aldıgı ß-laktam grubu antibiyotikler ise “bakterisidal” etki gösterirler, yani bakterinin ölümüne neden olurlar. Bakteriyostatik etkili antibiyotikler, immün sistemin de yardımıyla çogu infeksiyonda basarılı sonuç vermektedir. Immün sistemi yeterli olmayan hastalarda, immünosüpresif ilaç kullananlarda bakteriostatik etki yeterli olmamakta ve bakterisid etkili antibiyotiklerin kullanımı gerekmektedir. Bu antibiyotiklerin mutlaka kullanılması gereken durumlar; endokardit, menenjit, osteomiyelit gibi infeksiyon hastalıklarıdır. Immün sistemin infeksiyon alanında yeterince etkili olamadıgı bu tip durumlarda bakterisidal etkili antibiyotikler tercih edilmelidir.
Antibiyotiklerin bakteriler üzerinde olusturdukları etkileri incelemek için pek çok yöntem gelistirilmistir. Diger bölümlerde çogalmayı baskılayan en düsük antibiyotik yogunlugunun yani MIK ölçümü veya antibiyotik disklerinin uygulanmasıyla duyarlılık ölçümü anlatılmıstır. Bu bölümde ise bakterisidal etki belirlenmesi için kullanılan yöntemler anlatılacaktır.
YÖNTEMLER
Antibiyotik - bakteri etkilesimini degerlendirmek için olusturulan yöntemlerde, belirli miktarda bakterinin belirli yogunluktaki antibiyotikle belirli bir süre teması gerekmektedir.
Bu süre sonrasında canlı bakteri sayılması ise bakterisidal etki belirlenmesinde temeldir.
Bakterisidal etkiden bahsedebilmek için canlı bakterilerin miktarının %99.9 azalması gerekmektedir. Iki farklı yöntem bu etkinin belirlenmesinde kullanılır:
a) En küçük bakterisidal konsantrasyon (MBC): Bir gecelik inkübasyondan sonra (18-24 saat) canlı bakterilerin sayımı esasına dayanır. Bu ise, baslangıçtaki bakterilerden belirli bir kısmını öldüren en düsük antibiyotik yogunlugudur.
b) Time kill: Zamana ve antibiyotik yogunluguna baglı olarak, antibiyotigin bakterisidal etkisini dinamik olarak ortaya koyan bir yöntemdir. Bu yöntemde, bakteri miktarındaki azalma zamana baglı olarak her bir bakteri yogunlugu için ayrı verilir. Zamana baglı azalma için farklı zamanlarda canlı bakteri sayımı yapılır.
Minimal Bactericidal Concentration (MBC) : MIK degerinin belirlenmesinin ardından yapılır. MIK degeri ve üzerindeki konsantrasyonlarda canlı bakteri sayımı yapılır.
Bakterisidal etki, baslangıçtaki canlı bakterilerin azalmasını saglayan en düsük konsantrasyondur. Bu azalma Fransa’da %0.01, Ingiltere’de %0.1 olarak degerlendirilir.
Baslangıçtaki inokülum 105 bakteri (CFU) / ml’dir (100000). Yani Fransızlara göre <101 CFU / ml (<10), Ingilizlere göre <102 CFU / ml (<100). Eger MBC degerinin MIK degerine oranı 1 veya yakınsa bakterisidal etkiden bahsedilebilir. Bu oran, antibiyotik bakterisidal etkili olmasına karsın bazı suslar için 32 veya daha fazla olabilir. Bu durumda toleranstan bahsedilir. Vankomisine toleranslı Streptococcus pneumoniae susu tanımlanmıstır. MIK degerleri degismemekle birlikte, streptograminlerin stafilokoklar ve enterokoklar için bakterisidal etkilerinin, bu susların ribozomu metilleyen bir enzim için kodlanan erm genleri içeren suslarında görülmüstür.
TIME KILL YÖNTEMI
Besi yeri: Sıvı besi yeri olarak Mueller Hinton Broth kullanılır. Canlı bakteri sayımı için bakteri cinsine göre Triptik Soy Agar veya Kanlı Agar kullanılabilir.
Inokülum: Baslangıçta 105 CFU / ml kullanılır.
Gerekli malzemeler:
Hemoliz tüpleri
15 ml’lik tüp
Çalkalamalı ben mari
Etüv
Dilüsyon tüpleri
Hazırlanısı
MIK degerinin 2 alt ve üst konsantrasyonlarında antibiyotik içeren 5 ml MH besiyeri hazırlanır. Örnegin; eger test edilecek bakterinin MIK degeri 1mg/L ise 0.25, 0.5, 1, 2 ve 4 mg/L antibiyotik içeren tüpler seri dilüsyonla inokülum eklenmesine hazır hale getirilir.
Inokülum Hazırlanması
Time kill için baslangıçta 105 CFU / ml bakteri gerekmektedir. Gecelik besi yeri 109 CFU /ml bakteri içerir. Eger bu kültürden 50 μl alırsak 5X107 CFU almıs oluruz. Bunu 5 ml besiyerinde dilüe edersek yaklasık 5X105 CFU / ml bakteri inoküle etmis oluruz.
Saat 0’da örnek alınması
Kontrol tüpü ve antibiyotik içeren tüpleri bakteri ile inoküle eder etmez her tüpten 100 μlalınır ve 900 μl su içeren hemoliz tüplerine aktarılır. Aktarılan 1. tüpten 100 μl alınarak yine 900 μl su içeren 2. tüpe aktarılır. En az 3 kez pipetajla karıstırıldıktan sonra 100 μl alınır ve 3. tüpe aktarılır. Her konsantrasyon tüpünden ve kontrol tüpünden 6 dilüsyon hazırlanır.
Yani total 0. Saat için 6X6=36 tüp hazırlanır. Hazırlanan her tüpten 100 μl alınarak agar besi yerine yayılır. Agar petrilerinin arkasına hangi antibiyotik dilüsyonundan alındıgı petrilerin arkasına hangi k onsantrasyondan, kaçıncı saatte alındıgı ve hangi dilüsyon oldugu yazılmalıdır.
Inokülasyon sonrası 3. saatte örnek alınması
Inokülasyon saatinden 3 saat geçtikten sonra, 0. saatte yapıldıgı gibi her konsantrasyondan 0.1ml örnek alınarak 6 seri dilüsyon hazırlanır ve her bir dilüsyon TS agar içeren besi yerine yayılarak ekilir. Petrilerin yazılmasının önceden yapılması daha uygun olur.
Diger saatlerde örnek alınması
Laboratuvara göre degismekle birlikte en uygun yöntem 0, 3, 6, 12 ve 24. saatlerde
örnekleme yapılmasıdır. 12. saat geceye kalacagı için bazı laboratuvarlarda 0, 2, 4, 6 ve
24. saatlerde örnekleme yapılması tercih edilmektedir.
Koloni sayımı
Çalısılan saatlerde her konsantrasyon için 6 petriye dilüsyonlarla ekim yapılmıstır. Bu petrilerden her biri için sayım yapmaya gerek yoktur. Hangi dilüsyonda 30-300 arası koloni olusmussa o petrideki koloniler sayılır. Petrinin iki veya dörde bölünerek yalnızca bir alanda sayım yapılıp, bölünen alan sayısıyla çarpılması suretiyle toplam koloni sayısının elde edilmesi uygun bir yöntem degildir. Sayım gözle, kalemle veya otomatik sayıcılarla yapılabilir.
Koloni sayısının hesaplanması
Ekim yapılırken dilüsyon yapıldıgı için koloni sayımında da bu göz önüne alınmalıdır.
Örnegin; eger 3. dilüsyonda 112 koloni saydıysak antibiyotikli besiyerinde mililitreye düsen canlı bakteri sayısını CFU / ml cinsinden nasıl hesaplarız?
112 koloni demek 1,12 X 102 koloni denektir.
3. dilüsyon oldugu için 103 eklenir.
Besiyerinden 0.1ml örnek aldıgımız için ml’deki konsantrasyonu hesaplamak için 101 daha eklenir.
3. dilüsyonda 112 koloni sayılan antibiyotikli besi yerindeki total koloni sayısı 1,12 X 102+3+1
yani 1,12 X 106 olur.
Sekil 3’de verilen örnekte koloni sayımı
MIK konsantrasyonu için 5. Dilüsyon sayım için kullanılacaktır. Diger petrilerde koloni sayısı 30-300 koloni sınırında olmadıgı için bu petriler sayım için kullanılmaz. Bu dilüsyondaki sayıma göre MIK konsantrasyonunda 4,1X101+1+5 koloni yani 4,1X107 koloni vardır.
2XMIK konsantrasyonunda ise 2. dilüsyon koloni sayımının yapılması gereken petridir. Bu petride 48 koloni oldugu için total 2 MIK konsantrasyonundaki bakteri miktarı 4,8X101+2+1 yani 4,8X104 olarak hesaplanır.
4XMIK konsantrasyonunda da dilüsyonlarda sayılabilir petri yoktur. Sayım için dilüsyonsuz ekime basvurulabilir. Veya 4X101 olarak degerlendirilebilir. Eger baslangıç konsantrasyonu 106 ise 3 log’dan fazla azalma vardır (6.9-1,6=5,3 log) ve bu konsantrasyonda antibiyotik bakterisidal etkilidir.
Log(10) cinsinden degerlerin hesaplanması
Örnegimizde MIK konsantrasyonu için 4,1X106 koloni hesaplamıstık. Bu degeri grafik olarak ifade etmek için Log(10) degerlerini hesaplanması gerekmektedir. Bunu logaritma hesaplayan bir hesap makinesinde yapabiliriz. Sekil 3’de verilen örnekte 3. saatteki MIK, 2MIK ve 4MIK degerleri logaritmik degerlere dönüstürdügümüzde elde ettigimiz sonuçlar Sekil 4’deki grafikte kullanılmıstır; 4,1X106 için log degeri 6,61, 4,8X104 için 4,68 ve 4X101 degeri için 1,6 degerleri bulunmustur. Bu degerleri Excel sayfasına yerlestirdigimizde ve zaman-konsantrasyon iliskisi ile grafik çizdirdigimizde time kill grafigi elde etmis oluruz.
PROTOKOL
Hazırlık
Test edilecek bakteri için test edilecek antibiyotigin MIK degerinin bilinmesi gerekir. Bu amaçla kitabın makrodilüsyon bölümünde yazıldıgı gibi MIK tayini yapılır. Hemoliz tüpleri agızları pamukla kapalı halde pastör fırınında steril edilir. Bir antibiyotigin 1 sus üzerine bakterisidal etkisini ölçmek için 1 kontrol ve 5 antibiyotik konsantrasyonu olmak üzere 6kültür / her kültür için 6 / 0, 3, 6, 12 ve 24 olmak üzere toplam 5 zamanda ölçülecegi için 6 X 5 X 5 = 150 hemoliz tüpü / 150 agar pleyt gerekmektedir. Hemoliz tüplerine 0.9 ml steril distile su veya MH broth eklenir.
Bir önceki aksamdan 5ml MH broth’a test edilecek bakteri antibiyotik eklenmeden ekilir.
1. Gün
Eger vankomisin MIK degeri 2 olan S. aureus susu ile çalısıyorsak; 30
-1/4MIK, 1/2 MIK, MIK, 2MIK ve 4 MIK konsantrasyonlarında bakteri kültürü hazırlamak gerekir. Eger test edilecek susun MIK degeri 2 μg/ml ise 4X MIK degeri 8μg/ml olacaktır. 10 ml MH broth bulunan besi yerinde 8μg/ml antibiyotik konsantrasyonu için 80μg vankomisin eklemek gerekir. Eger 2 mg / ml vankomisin içeren antibiyotik solüsyonumuz varsa içeren her μl’de 2 μg vankomisin içereceginden 40 μl stok solüsyonunu 10 ml besi yerine eklenir. Eklemeden önce 10 ml’den 40 μl besi yerini alınması gerekir ki hacim degisikligi konsantrasyonu etkilemesin. Pipetleme yoluyla karıstırdıktan sonra 5 ml alıp 5ml MH broth bulunan tüpe aktarılır ve karıstırılır. Böylece 2. tüpteki antibiyotik
konsantrasyonu yarıya yani 4 μg / ml’ye düsmüs olur bu da 2X konsantrasyonudur. Sırayla 3., 4. ve 5. tüplere de seri dilüsyon yapılır ve 2, 1 ve 0.5 μg / ml’lik MIK, 1/2MIK ve 1/4MIK konsantrasyonları elde edilmis olur. Son tüp dilüsyonunda karıstırdıktan sonra 5 ml alınarak atılır böylece tüm tüplerde 5 ml kalmıs olur. Çogalma kontrolü için 1 tüp de antibiyotiksiz hazırlanır.
-Hazırlanan 6 adet 5 ml besi yeri içeren tüplere 50 μl, gecelik kültürden eklenir ve karıstırılır.
-Bakteri çogalmaya baslamadan örnek alınması gerekir. Her bir konsantrasyondan ve kontrol kültürden 100 μl alınıp 900 μl distile su bulunan hemoliz tüpüne eklenir. Kültürler 37ºC’da çalkalamalı ben mari içinde inkübe edilir.
-Kültürden 100 μl eklenmis 1. dilüsyon tüpünden 100 μl alınır ikinci dilüsyon tüpüne eklenir karıstırılır ve 100 μl 3. dilüsyon tüpüne eklenir ve sırayla 4., 5. ve 6. dilüsyon tüplerinde seri dilüsyona tabi tutulur.
Ekim
Dilüsyonlar hazırlandıktan sonra mümkün oldugunca çabuk ekim yapılması gerekir. Her dilüsyonda 100 μl alınarak TS veya kanlı agara ekilir. Petrinin her alanına yayılacak sekilde ekilir. L haline geririlmis Pastör pipeti veya plastik L bageti bakterileri yaymak için kullanılabilir. Eger en küçük dilüsyondan yaymaya baslanırsa aynı pastör pipeti ile yayılabilir.
Inkübasyon.
Inkübasyon sıcaklıgı ve ortamı test edilen bakteriye göre degisir. Eger S. aureus için test yapılıyorsa 37ºC ve normal havada inkübasyon yapmak gerekir. Inkübasyon süresi 18-24 saattir.
-Ekim ve örnekleme islemleri 3., 6., 12. ve 24. saatte tekrarlanır
Sonuç.
Bakterisidal etki zaman ve konsantrasyon bagımlı olarak time kill testi ile gösterilir. Eger 3 log azalma varsa bakterisidal etkiden bahsedilir. Sekil 5’de 100000 yani 11X105 koloni ile MIK ve 2MIK konsantrasyonlarında antibiyotikli besi yerinde inkübe edilen bakterilerde MIK konsantrasyonunda koloni sayısı 10X105 den 10X103 düzeyine kadar inmis yani bakterisidal etki 24 saat boyunca gözlenmemistir. 2 MIK konsantrasyonunda ise 3. saatte koloni sayısı 10X102 ‘nin altına inmis ve 24 saat boyunca bu düzeyin altında kalmıstır. 3 log’luk azalma <10X10 CFU oldugundan “2MIK konsantrasyonda test edilen antibiyotik 3. saatten itibaren bakterisidal etki gösteriyor” denebilir.
Kaynakça
Antibiogramme. 2006. Courvalin P, Leclercq R, Bingen E. Edition ESKA Paris L’Antibiogramme 1985. Courvalin P, Goldstain F, Philippon A, Sirot J. Edition MPC Brüksel.
Bactericidie: Aspects Theorique et Therapeutiques. 1990. Courvalin P, Drugeon H, Flandrois JP, Goldstein F. Edisyon Maloine. Paris
Mikrobiyoloji
-
Antibiyotiklerin Etki Mekanizmaları Nelerdir?
-
Azot oksit
-
Petri Kutusunda Agarlı Besiyeri Hazırlanması
-
Tüpde Agarlı Besiyerlerinin Hazırlanması
-
Besiyeri Hazırlarken Dikkat Edilecek Hususlar Nelerdir ?
-
Dehidre Besiyerleri Nedir?
-
Besiyerinin Sahip Olması Gereken Özellikler
-
Besiyeri hazırlanmasında kullanılan maddeler nelerdir ?
-
Besiyerlerin Sınıflandırılması Nasıl Yapılır ?
-
Besiyerinin Tanımı ve Kullanım Amaçları Nelerdir ?
-
Pseudomonas Cinsine ait Türler
-
Veba - Yersinia Pestis
-
Tularemi - Francisella tularensis
-
Şarbon - Bacillus anthracis Enfeksiyonu
-
Bruselloz - Brucella spp