BAZI ÖZEL HİSTOLOJİK PREPATATLARIN YAPIMI
1-KAN PREPARATI: Omurgalı kanı iki türlü incelenir.
a-Canlı olarak
b-Tespit edilmiş ve boyanmış olarak
a.Canlı olarak preparat hazırlanması: Doğrudan doğruya parmaktan lama alınan kan incelenir veya % 0.9’luk fizyolojik su içine kan damlatılıp , incelenir. Eritrositler birbirinden ayrıldığı için iyi görülür.
Ayrıca 300 mg Ruj.nötr 100 cm3 saf suda eritilir. Bir damla lam üzerine konur sonra diğer bir lamın kısa kenarı ile bu sıvı lam üzerine yayılır ve kurutulur. Sonra bir damla kan konur ve lamel kapatılır. Bir süre sonra kan hücrelerinin bu boyayı alarak çeşitli renklerde oldukları görülür. Eritrositler bu boyayı almazlar. Sıcak kanlı hayvanların lökösitlerin ameboid hareketlerini görmek için lam hafifçe ısıtılır. Soğuk kanlılarda oda sıcaklığında bu hareketi görebiliriz.
b- Tesbit edilmiş ve boyanmış olarak: Alkolde temizlenen parmak ucundan sterilize iğne ile çıkarılan kan temiz bir lam üzerine konur. Başka bir lamın kısa kenarı ile iyice yayılır. Biraz kuruması beklenir, sonra metil alkol içinde 3 dakika bekletilir. Daha sonra lam üzerine saf su damlatılır. Biraz bekletilir, suyu akıtıldıktan sonra bir kap içindeki Giemza boyasına konur (10 cc distile su+1 cc Giemsa ). 30 dakika bekledikten sonra çeşme suyunda yıkanır, kurutulur, incelenir.
2-MİTOZ BÖLÜNME PREPARATI
Kuru soğan ya da arpacık soğanı kökleri su içine gelecek şekilde suyun içine konur.
Üç hacim absolü alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içine uzayan köklerin uç kısımları kesilerek biriktirilir.
Bu karışımdan çıkan kökler 3 N HCl içinde 2-3 dakika bırakılır ( 24 cc HCl alınır. 100 cc ye distile su ile tamamlanır.
100 cc % 50’ lik asetik asit içine 1 gr orcein konur. Asitten çıkarılan kökler boya içinde 1.5 saat bekletilir.
Lam üzerine 1 kök konur. Üzerine 1 damla % 45’ lik asetik asit damlatılır.
Üzerine lamel kapatılır. Gazlı bez yardımıyla üstten bastırılarak yayılır ve mikroskopta incelenir.
3-MAYOZ BÖLÜNME PREPARATI
1-Çekirge testisleri çıkarılır.
2-3 hacim alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içersinde 24 saat buzdolabında fikse edilir.
3-Saklamak için % 70 ‘lik alkol kullanılır.
4-Boya 1 gr orcein
100 ml % 50 ‘lik Asetik asit içinde çözülür 30 ‘ dakika
5-% 45 ‘lik asetik asit damlatılıp ezilir.
6-Mikroskopta incelenir.
4-DÜZ KAS PREPARATI ( KURBAĞA MESANESİNDEN )
Araç ve Gereçler
Kurbağa
Şişe mantarı
Lam, lamel, makas, pens, küvet
Bouin, etil alkol, eter veya kloroform
Bouin Çözeltisi
9 gr pikrik asit 75 cc distile suda çözülür ( %74’ lük )
% 40’ lık formol...........25 cc
Glasiyal asetik asit.......5 cc
Bouin taze hazırlanır. Asetik asit buharlaştığından çözeltinin yapısı bozulabilir. İyi saklanırsa uzun süre kullanılabilir. Mesaneyi iyi fikse ettiği gibi sertleştirerek kolay boyanır hale getirir. Hemalum % 1’ lik suda hazırlanmış olarak kullanılır. Eozinin ise % 70’ lik etil alkolde hazırlanmış % 1 ‘ lik çözeltisi kullanılır.
Kurbağa bayıltılır. Mesanesi kesilerek alınır. Parafinde kaynatılmış veye doyurulmuş, ortası delik mantarın delik kısmı üstüne iğne ile gerilir. Bouin çözeltisine aktarılır. Mesane alt yüzeyde olmalı ve Bouin ile temas etmelidir. 1-2 saat sonra mesane sarı renk alır ve sertleşir. % 70’ lik alkole aktarılır. Objenin rengi giderilinceye kadar alkol değiştirilir. Sonra hemen hematoksilen ile istenilen mor renk alınıncaya kadar boyanır. Eozin ile 15 dakika boyanır. % 70-90-100’lük etil alkollerde 10’ ar dakika dehidre edilir. Ksilolde 5 dakika tutulur. Pensle çıkarılan materyel filtre kağıdı üzerine alınır. Mesane küçük parçalara ayrılarak lam üzerine alınır. Entellan damlatılarak lamel kapatılır. Kurutulur ve incelenir.
5-ÇİZGİLİ KAS PREPARATI (Çekirgeden): Çekirgenin abdomeni açılır. 2 kas demeti görülür. Steromikroskop altında kas çıkarılır. % 0.6’ lık fizyolojik sıvıya konur (NaCl ile hazırlanmış ). Buradan 1 hacim asetik asit+3 hacim % 96’ lık etil alkol içeren tespit çözeltisine aktarılır. Burada demet halindeki kaslar iğne veya pensle küçük parçalara ayrılır. 1 kas lifi lama alınır. Üzerine 1-2 damla asetocarmin damlatılır, 1-2 dakika beklenir. Üzerine lamel kapatılır ve hafifçe bastırılır. Sonra lamelin bir tarafından asetocarmin çekilip diğer taraftan % 96’ lık alkol eklenir. Bu işlem 2 defa tekrarlanır. Lameli yavaşça kaldırıp 1 damla kanada balzamı veya entellan damlatılır ve lamel kapatılır. Bu işlemlerin lamel kapatılarak yapılmasının nedeni kas üzerinde baskı yapmaktır. Baskı olmadığı zaman kas büzülür.
6-KEMİK PREPARATI
Araç ve Gereçler
% 5- % 7.5’ lik Nitrik asit ( 100 cc % 65’lik nitrik asit+1200 cc distile su)
% 5’ lik sodyum sülfat
Etil alkol
Kreozot (karanfil yağı )
Uzun kemik (3-5 cm boyunda )
Preparasyon 2 teknikle yapılabilir.
1-Yumuşatma: Gerekli maddeler bulunduğu takdirde daha kolay ve uygun bir tekniktir.
2-İnceltme: Daha çok el becerisine dayanır.
a-Kemiğin yumuşatılarak preparat hazırlanması: Uzun kemik parçasının üzerindeki yağ, kas kısımları bistüri ile temizlenir. Kemiğin anorganik yapısını eritmek için % 5 veya 7.5 lik seyreltilmiş nitrik asit içine konur., 24-48 saat bırakılır. Sık sık çalkalanır. 5 saatte bir çözelti tazelenir. Kemikler jiletle kesilecek kadar yumuşayınca çıkarılır.. 24-48 saat kadar % 5’lik sodyum sülfat içinde bırakılır. Sonra asitin giderrilmesi için çeşme suyunda 1-2 gün yıkanır.
Keskin jiletle yumuşamış ve yıkanmış kemikten çok ince kesitler alınarak % 50 ve % 70’ lik alkol bulunan petri kaplarında 10-60 dakika bekletilir. Kreozot içine alınarak 15-20 dakika şeffaflandırılır. Temiz bir lam üzerine alınan kemik kesiti üzerine entallan damlatılarak lamelle kapatılır.
Kesitler düzgün ve yeterli incelikte alınmışsa Havers kanalları ve konsantrik lameller izlenir. Boyuna alınan kesitlerle de Volkman ve Havers kanalları ve lameller izlenir. Mikroskopta inceleme yaparken diyafram kısılırsa daha iyi görüntü alınır.
b-Kemiğin inceltilmesi ile preparat yapımı: Uzun kemiklerden kemik testeresi ile enine parçalar kesilir. Bunlar döner zımpara taşlarında ( elektrikli veya kolla dönen ) mümkün olduğu kadar inceltilir. Daha sonra kesilen bir tahta üzerine koyarak ince dişli demir eğici ile çalışarak inceltmeye devam edilir. Bu arada kesitler incelendikce daire şeklindeki kesitten kopmalar olur. Kopan parçalar ponza taşında tekrar inceltmeye devam edilir. Ponza taşı üzerinde düzgün bir yüzey elde edilir. Bu yüzey üzerine su damlatılır. Ve kesitler parmak ucu ile taş üzerine sürtülerek daha da inceltilir.
Parmak ucunda tutulan kesitlerden parmağın izleri görünüyor ise kemik parçaları yeteri kadar incelmiş demektir.
İnceliği uygun görülen kesitler 5-10 ‘kadar HNO3 de bekletilir. Sonra damıtık suda birkaç değiştirme ile iyice yıkanır. Filtre kağıdından suları süzülür. Dikdörtgen veya kare şeklinde kesilerek lama yerleştirip lamel kapatılır.
Kesiler saydam olduğu için kanada balzamının ksilol ile seyreltilerek kullanılması tercih edilir.
7-KIKIRDAK PREPERATI
Kurbağanın ön ve arka ekstremitelerinin eklem yerlerindeki kıkırdak kullanılır. Hayvan eter veya kloroformla bayılttıktan sonra ekstremitlerinden biri eklem yerinden kesilir. Kasları kemikten ayrılır. Temizlenmiş olan kemik fizyolojik suya konur (%0.8 NaCl).
Keskin bir jiletle uzun kemiklerin uçlarındaki mavimsi renkli kıkırdaktan ince kesitler alınıp, fizyolojik suda lamel altında incelenir. Kıkırdak ara maddesi bu bölgede homojendir.
Kapsülde genellikle bir kıkırdak hücresi bulunur. Ara maddeleri açık gri kapsül beyaz renkli , plazma ve nukleus mavimtrak görünür. Bunu boyamak için Karmin- Asetik Bunu boyamak için Karmin -Asetik asit kullanılır. Bu boya fiksatiftir. Onun için kesit lam üzerine konan 1-2 damla asetokarmin içinde 1-2 dakika bekletilir, lamel kapatılır. Bu arada materyal tespit edildiği için hücreler büzülür. Nukleus kırmızı, plazma pembe boyanır. Kapsül ve ara madde az boyanır veya hic boyanmaz.
Preparatın devamlı olması için : Boyanan kesit % 96 lık alkolde 5 dakika tutulur. Sonra kreozt veya karanfil yağı içine konur. En fazla yarım saatte bu kesiler şeffaflaşır. Temiz bir lama bir damla Kanada balzamı veya entellan damlatılır. Kesit bunun üzerine yerleştirilir ve lamel kapatılır.
b- Kıkırdak pikrik asit içermeyen herhangibir fiksatif içinde tespit edilir. Sonra iyice yıkanır. Aşağıda formülü verilen Von Wijre boyasında 24 saat boyanır.
%70’ lik etil alkol.......................100 cc
HCL.............................................0.1 cc
Toluidin mavisi ........................ 0.1 gr
Boyadan sonra % 70 alkol içinde (0.001 HCL li) hiç boyası çıkmayıncaya kadar kalacak, % 70-80 -90-100 alkol serilerinde dehidrasyon yapılarak şeffaflaştırıcı (kreozot) içine aktarılır. Lam üzerine alınınca 1 damla Kanada balzamı veya entellan eklenerek lamel kapatılır.
8- KURBAĞA DERİSİ
Kurbağanın sırt derisi kesilerek delikli bir mantar üzerine gerilir. Bouin de 3-4 saat tesbit edilir. İğneleri çıkartılarak ufak parçalara bölünür. Sarı rengi giderilinceye kadar % 70 alkolde yıkanır.
% 80’lik etil alkolde 1 saat
% 90’lik etil alkolde 1 saat
% 100’ lık etil alkolde 1 saat
Ksilol + %30’luk alkolde 15-30'
Ksilolde 30 dakika
Ksilol+parafinde 30 dakika
Etüvdeki parafinde 24 saat
Bloklanır. Daha sonra mikrotomda 12 mm’lik kesitler alınır. Kesitler bir gün bekletilir.
Ksilolde 5-10 dakika
Alkol serilerinde (% 100-96-80-80 ) beşer dakika
Hematoksilen
Akarsuda 15 dakika boyama
Eosin (Eosin su ile yapıldıysa akarsudan sonra . %80’ e kadar alkol serilerinden geçirilir sonra eosinle boyanır ).
% 96 - %100’ lik alkol 1-2 dakika
Ksilol 2-3 dakika
Kanada balzamı ve lamel kapatılması
9-DEV KROMOZOMLARIN PREPARATI: Bu teknikte absolü metil alkol sadece tespit ve lamel kapatma sırasında çözücü olarak kullanılır. Ringer çözeltisi içine alınan ganglion veya tükrük bezi temiz bir lam üzerine alınır. Üzerine 1 damla % 45’ lik asetik asit eklenerek 3-4 dakika tespit edilir. Fazla tutulursa parçalanır. Lamel kapatılır. Fiksatifin fazlası emdirilir.
Kullanılan lam daha önceden albümin veya başka bir yapıştırıcı sürülmüş ve kurutulmuş olmalıdır. Lam ve lamel içinde alkol bulunan bir kaba aktarılır. 12 saat ya da daha fazla bekletilir. Lamel kendiliğinden düşmemişse ince bir iğne yardımı ile lamel alınır. Üzerine tükrük bezi yapışmış lam alkolde doyurulmuş amonyum ferri sülfat bulunan kaba taşınır. 12 saat bekledikten sonra biraz hematoksilen kristali boyaya aktarılır. Alkol banyosundan sonra 5-10 dakika alkolde doyurulmuş lityum karbonat çözeltisinde bekletilir. Kırmızı bir boyama yapılacaksa 1-3 saniye alkolik eozinde ( 100 cc % 90’ lık alkol+ 0.5 gr eosin ) bekletilir. Entellan damlatılarak lamel kapatılır.
Histoloji Laboratuvarı
-
Glasiyal asetik asit (CH3COOH) nerelerde kullanılır? nasıl hazırlanır ?
-
Formaldehit özellikleri nelerdir? nasıl hazırlanır
-
Histoloji Preperatların Etiketlenmesi
-
DONDURMA YÖNTEMİ
-
Histoloji Preparatı Kesit alma işlemi
-
HİSTOLOJİ PREPARATLARININ LAM ÜZERİNE YAPIŞTIRILMASI
-
PARAFİN KESİTLERİN HAZIRLANMASI
-
TEMELİNDE SUBLİME VE KARIŞIMLARI BULUNAN TESPİT SOLUSYONLARI
-
TEMELİNDE PİKRİK ASİT BULUNAN TESPİT SOLUSYONLARI
-
TEMELİNDE DİKROMAT BULUNAN TESPİT SOLUSYONLARI
-
ETİL ALKOL BULUNAN TESPİT SOLUSYONLARI
-
FORMALDEHİTLİ TESPİT SOLÜSYONLARI
-
İyi bir fiksatifte aranan nitelikler
-
Fiksatif seçimi ve süresi
-
E- MASERASYON YÖNTEMİ