DNA profilleme yöntemi
İşlem, kişinin DNA'sından bir örnek almakla başlar (buna genelde "referans örnek" denir). Referans örneği elde etmenin en arzu edilen yöntemi yanak içi sürüntüdür, çünkü bu kontaminasyon olasılığını düşürür. Bu mümkün olmadığı zaman, (örneğin mahkeme emri gerekmektedir ve yoktur) başka yöntemlerin kullanılması gerekbilir (örneğin, diş fırçası, jilet, vb.) veya depolanmış örnekler (dondurulmuş sperm veya biyopsi dokusu). Biyolojik akrabalardan elde edilen örnekler veya daha önceden profillemesi yapılmış insan kalıntıları da kişinin profili hakkında bilgi verebilir
Referans örnek aşağıda ayrıntıları verilen tekniklerden biri ile analiz edilerek kişinin DNA profili elde edilir. DNA profili sonra başka bir örneğinki ile karşılaştırılarak genetik bir eşleşme olup olmadığı belirlenir.
RFLP analizi
DNA profillemesinde kullanılan ilk yöntemler restriksiyon enzimi sindirimi ve ardından Southern blot analizinden oluşmuştur. Restriksiyon enziminin kesim yerinde polimorfizm olabilse de, daha yaygın olarak enzim ve DNA probları VNTR konumlarının lokus analizinde kullanılmıştır. Fakat, Southern blot yöntemi emek-yoğundur ve çok miktarda yıkıma uğramamış örnek DNA'ya gerek gösterir. Ayrıca, Karl Brown'un özgün tekniği pek çok miniuydu konumuna aynı anda bakmaktaydı, böylece daha çok çeşitlilik gözlemlenebilmekte ama her bir alelin ayırdedilmesi daha zorlaşmaktaydı (bu yüzden de babalık testinde kullanılamıyordu). Bu ilk yöntemlerin yerini PCR'ye dayalı yöntemler almıştır.
PCR analizi
Ana madde: polimeraz zincir tepkimesi
polimeraz zincir tepkimesi (İng. polymerase chain reaction veya PCR) yönteminin icadı ile DNA profillemesi hem ayırdedicilik hem de çok düşük miktarlı (veya bozunmuş) başlangıç malzemesinden bilgi edebilme bakımından büyük aşamalar katetti. PCR, DNA'nın belli bir bölgesinin çok büyük miktarda çoğaltmak için kullanılır, bunun için oligonükleotit primerler ve ısıya dayanıklı DNA polimeraz kullanılır. HLA-DQ alfa ters dot blot şeritler gibi ilk testler, kolay olmalarından ve hızlı sonuç vermelerinden dolayı çok popüler oldular. Fakat, RFLP kadar ayırdedici değildiler. Ayrıca karışık örneklerden (örneğin bir cinsel taciz kurbanından alınma vajinal sürüntüden) DNA profili elde etmek zordu,
Bu sorunlara rağmen, PCR yöntemi VNTR lokuslarını analiz etmeye kolaylıkla uygulanabilir. ABD Federal Tahkikat Bürosu (FBI) DNA tiplemesi için 13 VNTR analizini standartlaştırmıştır ve adlî vakalarda kimlik tespiti için CODIS veritabanını düzenlemiştir. Başka ülkelerde de benzer testler ve veritabanları kurulmuştur. Ayrıca, SNP analizi için ticarî kitler de mevcuttur. Bu kitler ile bilinen varyasyonları olan genomik bölgeleri PCR kullanılarak çoğaltılır, bunlar özel kartlara tutturulmuş DNA probları ile hibridize edilir, bunun sonucunda belli bir dizinin varyasyonuna karşılık gelen renkli bir benek edilir.
STR analizi
Günümüzde kullanılan DNA profillemesi PCR ve kısa bitişik tekrarlara (İng. short tandem repeats veya STR) dayalıdır. Bu yöntemde kısa tekrar eden DNA dizilerine sahip, son derece polimorfik bölgelere bakılır (en yaygın olarak tekrar eden 4 bazlı bölgelere bakılır ama 3, 5 ve başka sayıda baz tekrarları da kullanılır). Akraba olmayan kişilerde bu tekrar eden birimlerden farklı sayılarda olduğu için, bu DNA bölgeleri birbirlerine akraba olmayan kişilerin ayırdedilmesinde kullanılabilir. Bu STR lokusları (konumları) dizi-spesifik primerler kullanılarak PCR ile çoğaltılır. Elde edilen DNA parçaları sonra elektroforez ile ayrıştırılır ve tespit edilir. Bu amaç için kullanılan iki elektroforez yöntemi vardır, kapiler elektroforez ve jel elektroforezi.
Her bir STR bölgesinde görülen polimorfizmlerin her biri oldukça yaygındır, tipik olarak her biri toplumun %5-20'si tarafından paylaşılır. Birden çok lokusa bakılınca bu polimorfizmlerin kombinasyonunun tek bir kişiye özgü olması, bu yöntemi kimlik tespitinde ayırdedici bir araç kılar. Ne kadar çok STR bölgesine bakılırsa test de o derece daha ayırdedici olur.
Farklı ülkelerde farklı STR-temelli DNA profilleme sistemleri kullanılır. Kuzey Amerika'da CODIS'teki 13 lokusu çoğaltan sistemler en yaygındır, Birleşik Krallık'ta ise o ülkenin Millî DNA veritabanı ile uyumlu olan SGM+ sitemi kullanılır. Bu DNA profilleme sistemlerinde aynı zamanda pekçok STR bölgesinin test edildiği çoklu tepkimeler kullanılır.
Kapiler elektroforezde, içi bir polimerlerle dolu ince cam tübün (kapiler veya kılcal tübün) içine DNA parçaları bir elektrik alanının etkisiyle (elektrokinetik olarak) enjekte edilir. Sonra, gene bir elektrik alanının etkisiyle DNA parçaları bu tüp içinde, küçük parçalar büyük olanlardan daha hızlı olmak üzere, ilerler. PCR sırasında kullanılan primerlere bağlanmış flüresan etiketler sayesinde kapiler tüpte ayrıştırılan DNA parçaların hangi tepkimenin ürünü olduğu anlaşılabilir. Bu sayede birden çok DNA parçasının PCR ile çoğaltılması ve beraber elektroforez edilmesi mümkün olur, buna multipleksleme denir. Farklı büyüklükte ve işaretlenmiş DNA standartlarının her bir örneğe dahil edilmesi ile parçaların büyüklükleri belirlenir, bu büyüklük bilinen tüm alelleri listeleyen bir tablo ile karşılaştırılarak polimorfik tekrar sayısı bulunur. Bu yöntem pahalı olmakla beraber yüksek kapasiteli makinalar kullanılarak örnek başına daha düşük bir masrafa ulaşmak ve çoğu adli laboratuvardaki iş yükünü azaltmak mümkündür.
Jel elktroforezi kapiler elektroforeze (KE) benzer bir prensibe göre çalışır ama DNA parçalarını ayrıştırmak için kapiler tüp yerine iki cam tabaka arasında oluşturulmuş bir poliakrilamit jel kullanılır. KE de olduğu gibi bir elektrik alan uygulanır ama tüm örneklerin tek bir detektör tarafından algılanması yerine küçük parçalar jelin alt ucuna varana kadar elektroforez yapılır, sonra tüm jelin görüntüsü taranarak bir bilgisayara yüklenir. Bu işlemle elde edilen görüntüde farklı tekrarların büyüklükleri ve bir alel "merdiveni" (tüm aleller merdiven basmakları gibi alt alta dizilidir) görünür. Bu yöntemde büyüklük standartları kullanılmaz çünkü örneklerin yanı sıra ayrıştırılan alel merdiveni aynı işe yarar. Görselleştirme için tarama yapmadan flüoresan işaretleme veya gümüş boyama kullanılır. Bu yöntem daha ucuz olmak ve işlem hacmi nispeten yüksek olmakla beraber STR analizi için gümüş boyama giderek daha az kullanılmaktadır. Çoğu laboratuvar, KE makinalarının fiyatları düştükçe jel kullanmaktan KE'ye geçmektedir.
STR analizinin en büyük avnatajı onun ayırdetmetmedeki istatiksek gücüdür. ABD'de, CODİS'e göre ayırdetme için kullanılan 13 esas lokus (genetik konum) vardır. Bu lokuslar birbirlerinden bağımsız olarak bir araya geldikleri için (bir lokustaki bir tekrar dizisinden belli sayıda olması başka bir lokustaki tekrar sayısına etki etmez), olasılıkların çarpımı kuralı uygulanabilir. Bu demektir ki, birbirinden bağımsız üç lokus için "ABC" DNA tipine sahip olma olasılığı, A olma olasılığı çarpı B olma olasılığı çarpı C olma olasılığıdır. Bu prensibe dayanarak bir kintilyonda bir (virgülden sonra 17 sıfır ve 1 ile gösterilen sayı) ve daha düşük olasılıklar elde etmek mümkündür. Ancak, dünyada 12 milyon eş yumurta ikizi bulunduğu için bu teorik olasılık hesabı aslında faydasızdır. Örneğin, rastgele seçilmiş iki kişinin aynı DNA'ya sahip olma olasılığı sadece 3 trilyonda birdir.
AmpFLP
Çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizmi (İng. amplified fragment length polymorphism veya AmpFLP) adlı bir diğer teknik, 1990'lar başında uygulamaya sokulmuştur. Bu teknik RFLP'den daha hızlı çalışır ve DNA örneklerini çoğaltmak için PCR kullanır. Değişken sayılı bitişik tekrar (İng. variable number tandem repeat veya VNTR) polimorfizmlerine dayalı aleller ayırdedilir, bunlar poliakrilamit jel elektroforezi ile ayrıştırılır. Bantlar gümüş boyaması ile görülür. Parmakizlemesi için sıkça kullanılan lokuslardan biri D1S80 lokusuydu. PCR'ye dayalı diğer yöntemler gibi, fazla bozunmuş DNA veya çok düşük miktarlarda DNA alel kaybına yol açabilmekte (öyle ki heterozigotik bir örnek homozigotik zannedilebilir) veya başka stokastik etkilere yol açabilmektedir. Buna ilaveten, analiz jelde yapıldığı için, çok yüksek sayılı tekrarlar jelin tepesinde sıkışabilirler ve birbirlerinden ayırdedilmeleri zor olabilir. AmpFLP analizi yüksek oranda otomatikleştirilebilir. Bu yöntemle kişisel DNA örnekleri karşılaştırılarak filogenetik ağaçlar yaratılabilir. Düşük maliyeti, hazırlanma ve çalıştırma kolaylığı gibi nedenlerden dolayı AmpFLP hâlâ az gelirli ülkelerde yaygın olarak kullanılır.
Y kromozom analizi
Y kromozomunun polimorfik bölgelerini hedefleyen primerlerin geliştirilmesi sayesinde, erkek ve kadından elde edilmiş karışık ve/veya ayrıştırılamayan örneklerin çözümü mümkün hâle gelmiştir. Y kromozomu babadan oğula aktarılır, dolayısıyla baba taraflı akraba olan erkeklerin tespitinde yardımcı olur. Sally Hemmings vakasında Amerikan başkanlarından Thomas Jefferson'un bir kölesinden çocuk sahibi olmuş olduğu göstermek için Y-STR analizi analizi kullanılmıştır.
Mitokondri analizi
Çok bozunmuş DNA örneklerinde CODISTe bulunan 13 STR'sinin tam bir profilini elde etmek bazen imkânsız olabilir. Bu tür durumlarda mitokondriyal DNA (mtDNA) tiplemesi yapılır çünkü hücreden mtDNA'nın pekçok kopyası vardır, oysa çekirdek DNA'sının 1-2 kopyası bulunur. Adlî bilimciler mtDNA'nın HV1 ve HV2 bölgelerini PCR ile çoğaltırlar, bu bölgeleri dizilerler, sonra tek nükleotit farklılıkları bir referans diziyle karşılaştırırlar. Mitokondriyal DNA anneden kalıtıldığı için birbiriyle doğrudan anne bağlantılı akrabalar eşleştirme referansı olarak kullanılabilir; örneğin birisinin anneannesinin kızının oğlu aynı mtDNA'ya sahiptir. Bir veya iki nükleotitlik bir fark, bir şüpheliyi dışlamak için yeterli sayılır. Heteroplazmi ve poli-C farklılıkları dizilerin doğrudan karşılaştırılmasını yanıltabilir, bu yüzden analistin belli bir uzmanlık seviyesinde olması gerekir. mtDNA kesin kimlik tespiti gereken durumlarda yararlıdır, örneğin anne tarafından bir akraba bulunabilen kayıp kişi vakalarında. mtDNA testi kullanılarak Anna Anderson'un iddia ettiği gibi Rus prensesi Anastia Romanov olmadığı belirlenebilmiştir. mtDNA, saçlardan ve eski kemik ve dişlerden elde edilebilir.
DNA veritabanları
Dünyanın çeşitli ülkelerinde DNA veritabanları bulunmaktadır. Bazıları özeldir aittir ama en büyük veritabanları devlet kontrolündedir. ABD, Birleşik DNA İndex Sistemi'ndeki (Combined DNA Index System) 5 milyondan fazla (2007'de) kayıt ile en büyük DNA veritabanına sahiptir. Birleşik Krallık'taki Millî DNA Veritabanı (National DNA Database veya NDNAD) benzer büyüklüktedir. Bu ülkede polisin DNA örnekleri elde etmek ve suçsuz bulunma durumunda dahi onları saklamakta geniş yetkileri vardır. Bu veri tabanının büyüklüğü ve büyüme hızı, kişisel özgürlük savunucusu gruplarca bir sorun olarak görülmektedir. ABD'deki U.S. Patriot Yasası başka ülkelere ait kuruluşlarda çalışan kişilerden DNA örnekleri alma hakkı vermektedir.
Bir suç mahalinde elde edilen örnek Millî DNA veritabanı'ndaki bir kayıtla uyuşursa, bu bulgu ilgili polis kuruluşuna bir ipucu olarak bildirilir. Ancak bu tür bir eşleşmenin mahkemedeki delil değeri düşük sayılır, veritabanından olmayan bir örnekle olan eşleşmeye kıyasla.
DNA delilini değerlendirmedeki faktörler
Adlî delil olarak genetik parmakizlemesinin kullanıldığı ilk yıllarda savunma avukatları, jüriler üzerinde oldukça etkili olan şu tip argümanlar yapardı: 5 milyonda birlik bir tesadüfi eşleşme olasılığı varsa 60 milyon nüfuslu bir ülkede bu DNA profiline uyan 12 kişi vardır; o halde, sanığın suçlu olma olasılığı 12'de birdir. Oysa bu argümanın geçerli olması için sanığın ülkedeki toplumdan rastgele seçilmiş olması gerekir. Jürinin düşünmesi gereken, bu DNA profiline uyan bir kişinin aynı zamanda başka nedenlerden dolayı davada bir şüpheli olma olasılığının ne olduğudur. Bir diğer aldatıcı istatistik argüman, bir kayıtlarla eşleşme için 5 milyonda birlik bir olasılık ile, suçsuz olma olasılığı için 5 milyonda birlik bir olasılığına karşılık geldiği varsayımına dayalıdır, bu argüman savcılık safsatası olarak bilinir.
RFLP kullanıldığında tesadüfi bir eşleşmenin teorik riski 100 milyarda bir, ama pratik risk binde bir olabilir çünkü eşyumurta ikizleri insan toplulukların %0,2'sini oluşturur. Üstelik, laboratuvarda teknik hata yapılması olasılığı muhtemelen daha yüksektir ve çoğu zaman laboratuvar yöntemleri, tesadüfî eşleşme olasılıklarının hesaplanmasında kullanılan varsayımlara karşılık gelmez. Örneğin, tesadüf olasılıkları hesaplanırken iki örneğin jeldeki bantlarının tam tamına aynı konumda olduğu esasına dayanılır, oysa bir laboratuvar teknisyeni benzer -ama tam tamına aynı olmayan- bantların jeldeki bir bozukluk yüzünden aynı olduğu hükmüne varabilir. Oysa, bu durumda, teknisyen eşleşme kriterini genişletmiş olduğu için tesadüf riski artmıştır. Yapılan bazı araştırmalar laboratuvar hata oranlarının göreli olarak yüksek bulmuştur. Genetik parmakizlemesinde, bir eşleşme olasılığını doğru olarak hesaplamak için gerekli olan topluluk verileri her zaman mevcut değildi. 1992 ile 1996 arasında, RFLP analizinde kullanılan eşleşme olasılıkları için teorik olarak hesaplanmış sınırlar yerine, keyfî olarak belirlenmiş daha düşük sınırların belirlenmesi tartışma yaratmıştır. Günümüzde, daha iyi ayırdedici, hassas ve kolay tekniklerin gelişmesi sonucu artık RFLP yöntemi yaygınlığını kaybetmiştir.
STR'ler bu tür sübjektiflik sorunu yaratmaz ve benzer bir ayırdetme gücü sağlarlar (akraba olamayan kişilerde 10^13'te bir tesadüf olasılığı, eğer tam SGM+ profili kullanılırsa). Ancak, Birleşik Krallık'taki bilim adamları bu mertebede olasılıkların istatistiksel olarak kabul edilemez olduğunu, DNA profili aynen uyuşan akraba olmayan kişilerde tesadüf olasılığını milyarda bir olduğunu savunmuşlardır. 1998'ten beri Birleşik Krallık'taki Millî DNA Veritabanı'nda kullanılan DNA profilleme sistemi SGM+'dır, bu sistem 10 STR bölgesi ve bir cinsiyet belirleyici test içerir. Ancak, hangi DNA tekniği kullanılırsa kullanılsın, tedbirli bir jüri üyesi sanığı suçlu bulmakta sadece genetik parmakizlemesi sonucunu kullanmamalıdır, eğer şüphe doğurucu başka kanıtlar bulunuyorsa. Hatalı DNA profili çıkmasının başlıca nedeni laboratuvarda başka delil numuneleri ile kontaminasyondur, bu yüzde favori savunma tekniklerinden biri, numunenin kasıtlı olarak kirletilmiş olabileceği hakkında şüphe yaratmaktır. Daha ender olarak, kimerizm, genetik eşleşme olmaması yüzünden şüpheli bir kişinin haksız olarak dışlanmasına neden olabilir.
Genetik ilişki delili olarak
DNA profillemesini genetik ilişki delili olarak kullanmak mümkündür. Ancak, olumsuz sonuçların mutlak anlamda kesin olmayabileceği testlerle gösterilmiştir. Çoğu kişide tek bir gen grubu bulunmakla beraber, "kimera" olarak adlandırılan bazı ender kişilerde iki farklı gen grubu olabilmektedir. DNA profillemesi ile bir annenin çocukları ile akraba olmadığını hatalı şekilde gösteren çeşitli vakalar bilinmektedir.
Sahte DNA delili
Bazı suçluların suç yerine sahte DNA örnekleri yerleştirdiği vakalar, DNA kanıtlarına ne derece değer verilmesi gerektiğini gündeme getirmiştir. Bir vakada, suçlu kendi vücuduna sahte DNA delili yerleştirmiştir: Dr. John Schneeberger 1992'de anestezi altında olan bir hastasının ırzına geçmiş ve onun iç çamaşırında meni bırakmıştır. Polis üç ayrı seferde Schneeberger'in kanını alıp kandaki DNA ile suç yerinde menideki DNA ile kıyaslamış, ve DNA profillerinde bir aynılık bulmamıştır. Sonunda ortaya çıkmıştır ki, Schneeberger kolunun içine bir Penrose dreni yerleştirmiş, onun için başkasının kanı ve antikogulanlarla doldurmuştur.
Herhangi bir DNA profili ile çakışacak DNA'yı standart moleküler biyoloji teknikleri kullanarak laboratuvarda sentezlemek mümkündür, bunun için birisinden DNA elde etmek gerekli değildir. Hâlen kullanılan adlî prosedürler suni ve doğal DNA'yı ayırdetmemektedir ama bunu yapacak teknikler üzerinde çalışılmaktadır.
Referans örnek aşağıda ayrıntıları verilen tekniklerden biri ile analiz edilerek kişinin DNA profili elde edilir. DNA profili sonra başka bir örneğinki ile karşılaştırılarak genetik bir eşleşme olup olmadığı belirlenir.
RFLP analizi
DNA profillemesinde kullanılan ilk yöntemler restriksiyon enzimi sindirimi ve ardından Southern blot analizinden oluşmuştur. Restriksiyon enziminin kesim yerinde polimorfizm olabilse de, daha yaygın olarak enzim ve DNA probları VNTR konumlarının lokus analizinde kullanılmıştır. Fakat, Southern blot yöntemi emek-yoğundur ve çok miktarda yıkıma uğramamış örnek DNA'ya gerek gösterir. Ayrıca, Karl Brown'un özgün tekniği pek çok miniuydu konumuna aynı anda bakmaktaydı, böylece daha çok çeşitlilik gözlemlenebilmekte ama her bir alelin ayırdedilmesi daha zorlaşmaktaydı (bu yüzden de babalık testinde kullanılamıyordu). Bu ilk yöntemlerin yerini PCR'ye dayalı yöntemler almıştır.
PCR analizi
Ana madde: polimeraz zincir tepkimesi
polimeraz zincir tepkimesi (İng. polymerase chain reaction veya PCR) yönteminin icadı ile DNA profillemesi hem ayırdedicilik hem de çok düşük miktarlı (veya bozunmuş) başlangıç malzemesinden bilgi edebilme bakımından büyük aşamalar katetti. PCR, DNA'nın belli bir bölgesinin çok büyük miktarda çoğaltmak için kullanılır, bunun için oligonükleotit primerler ve ısıya dayanıklı DNA polimeraz kullanılır. HLA-DQ alfa ters dot blot şeritler gibi ilk testler, kolay olmalarından ve hızlı sonuç vermelerinden dolayı çok popüler oldular. Fakat, RFLP kadar ayırdedici değildiler. Ayrıca karışık örneklerden (örneğin bir cinsel taciz kurbanından alınma vajinal sürüntüden) DNA profili elde etmek zordu,
Bu sorunlara rağmen, PCR yöntemi VNTR lokuslarını analiz etmeye kolaylıkla uygulanabilir. ABD Federal Tahkikat Bürosu (FBI) DNA tiplemesi için 13 VNTR analizini standartlaştırmıştır ve adlî vakalarda kimlik tespiti için CODIS veritabanını düzenlemiştir. Başka ülkelerde de benzer testler ve veritabanları kurulmuştur. Ayrıca, SNP analizi için ticarî kitler de mevcuttur. Bu kitler ile bilinen varyasyonları olan genomik bölgeleri PCR kullanılarak çoğaltılır, bunlar özel kartlara tutturulmuş DNA probları ile hibridize edilir, bunun sonucunda belli bir dizinin varyasyonuna karşılık gelen renkli bir benek edilir.
STR analizi
Günümüzde kullanılan DNA profillemesi PCR ve kısa bitişik tekrarlara (İng. short tandem repeats veya STR) dayalıdır. Bu yöntemde kısa tekrar eden DNA dizilerine sahip, son derece polimorfik bölgelere bakılır (en yaygın olarak tekrar eden 4 bazlı bölgelere bakılır ama 3, 5 ve başka sayıda baz tekrarları da kullanılır). Akraba olmayan kişilerde bu tekrar eden birimlerden farklı sayılarda olduğu için, bu DNA bölgeleri birbirlerine akraba olmayan kişilerin ayırdedilmesinde kullanılabilir. Bu STR lokusları (konumları) dizi-spesifik primerler kullanılarak PCR ile çoğaltılır. Elde edilen DNA parçaları sonra elektroforez ile ayrıştırılır ve tespit edilir. Bu amaç için kullanılan iki elektroforez yöntemi vardır, kapiler elektroforez ve jel elektroforezi.
Her bir STR bölgesinde görülen polimorfizmlerin her biri oldukça yaygındır, tipik olarak her biri toplumun %5-20'si tarafından paylaşılır. Birden çok lokusa bakılınca bu polimorfizmlerin kombinasyonunun tek bir kişiye özgü olması, bu yöntemi kimlik tespitinde ayırdedici bir araç kılar. Ne kadar çok STR bölgesine bakılırsa test de o derece daha ayırdedici olur.
Farklı ülkelerde farklı STR-temelli DNA profilleme sistemleri kullanılır. Kuzey Amerika'da CODIS'teki 13 lokusu çoğaltan sistemler en yaygındır, Birleşik Krallık'ta ise o ülkenin Millî DNA veritabanı ile uyumlu olan SGM+ sitemi kullanılır. Bu DNA profilleme sistemlerinde aynı zamanda pekçok STR bölgesinin test edildiği çoklu tepkimeler kullanılır.
Kapiler elektroforezde, içi bir polimerlerle dolu ince cam tübün (kapiler veya kılcal tübün) içine DNA parçaları bir elektrik alanının etkisiyle (elektrokinetik olarak) enjekte edilir. Sonra, gene bir elektrik alanının etkisiyle DNA parçaları bu tüp içinde, küçük parçalar büyük olanlardan daha hızlı olmak üzere, ilerler. PCR sırasında kullanılan primerlere bağlanmış flüresan etiketler sayesinde kapiler tüpte ayrıştırılan DNA parçaların hangi tepkimenin ürünü olduğu anlaşılabilir. Bu sayede birden çok DNA parçasının PCR ile çoğaltılması ve beraber elektroforez edilmesi mümkün olur, buna multipleksleme denir. Farklı büyüklükte ve işaretlenmiş DNA standartlarının her bir örneğe dahil edilmesi ile parçaların büyüklükleri belirlenir, bu büyüklük bilinen tüm alelleri listeleyen bir tablo ile karşılaştırılarak polimorfik tekrar sayısı bulunur. Bu yöntem pahalı olmakla beraber yüksek kapasiteli makinalar kullanılarak örnek başına daha düşük bir masrafa ulaşmak ve çoğu adli laboratuvardaki iş yükünü azaltmak mümkündür.
Jel elktroforezi kapiler elektroforeze (KE) benzer bir prensibe göre çalışır ama DNA parçalarını ayrıştırmak için kapiler tüp yerine iki cam tabaka arasında oluşturulmuş bir poliakrilamit jel kullanılır. KE de olduğu gibi bir elektrik alan uygulanır ama tüm örneklerin tek bir detektör tarafından algılanması yerine küçük parçalar jelin alt ucuna varana kadar elektroforez yapılır, sonra tüm jelin görüntüsü taranarak bir bilgisayara yüklenir. Bu işlemle elde edilen görüntüde farklı tekrarların büyüklükleri ve bir alel "merdiveni" (tüm aleller merdiven basmakları gibi alt alta dizilidir) görünür. Bu yöntemde büyüklük standartları kullanılmaz çünkü örneklerin yanı sıra ayrıştırılan alel merdiveni aynı işe yarar. Görselleştirme için tarama yapmadan flüoresan işaretleme veya gümüş boyama kullanılır. Bu yöntem daha ucuz olmak ve işlem hacmi nispeten yüksek olmakla beraber STR analizi için gümüş boyama giderek daha az kullanılmaktadır. Çoğu laboratuvar, KE makinalarının fiyatları düştükçe jel kullanmaktan KE'ye geçmektedir.
STR analizinin en büyük avnatajı onun ayırdetmetmedeki istatiksek gücüdür. ABD'de, CODİS'e göre ayırdetme için kullanılan 13 esas lokus (genetik konum) vardır. Bu lokuslar birbirlerinden bağımsız olarak bir araya geldikleri için (bir lokustaki bir tekrar dizisinden belli sayıda olması başka bir lokustaki tekrar sayısına etki etmez), olasılıkların çarpımı kuralı uygulanabilir. Bu demektir ki, birbirinden bağımsız üç lokus için "ABC" DNA tipine sahip olma olasılığı, A olma olasılığı çarpı B olma olasılığı çarpı C olma olasılığıdır. Bu prensibe dayanarak bir kintilyonda bir (virgülden sonra 17 sıfır ve 1 ile gösterilen sayı) ve daha düşük olasılıklar elde etmek mümkündür. Ancak, dünyada 12 milyon eş yumurta ikizi bulunduğu için bu teorik olasılık hesabı aslında faydasızdır. Örneğin, rastgele seçilmiş iki kişinin aynı DNA'ya sahip olma olasılığı sadece 3 trilyonda birdir.
AmpFLP
Çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizmi (İng. amplified fragment length polymorphism veya AmpFLP) adlı bir diğer teknik, 1990'lar başında uygulamaya sokulmuştur. Bu teknik RFLP'den daha hızlı çalışır ve DNA örneklerini çoğaltmak için PCR kullanır. Değişken sayılı bitişik tekrar (İng. variable number tandem repeat veya VNTR) polimorfizmlerine dayalı aleller ayırdedilir, bunlar poliakrilamit jel elektroforezi ile ayrıştırılır. Bantlar gümüş boyaması ile görülür. Parmakizlemesi için sıkça kullanılan lokuslardan biri D1S80 lokusuydu. PCR'ye dayalı diğer yöntemler gibi, fazla bozunmuş DNA veya çok düşük miktarlarda DNA alel kaybına yol açabilmekte (öyle ki heterozigotik bir örnek homozigotik zannedilebilir) veya başka stokastik etkilere yol açabilmektedir. Buna ilaveten, analiz jelde yapıldığı için, çok yüksek sayılı tekrarlar jelin tepesinde sıkışabilirler ve birbirlerinden ayırdedilmeleri zor olabilir. AmpFLP analizi yüksek oranda otomatikleştirilebilir. Bu yöntemle kişisel DNA örnekleri karşılaştırılarak filogenetik ağaçlar yaratılabilir. Düşük maliyeti, hazırlanma ve çalıştırma kolaylığı gibi nedenlerden dolayı AmpFLP hâlâ az gelirli ülkelerde yaygın olarak kullanılır.
Y kromozom analizi
Y kromozomunun polimorfik bölgelerini hedefleyen primerlerin geliştirilmesi sayesinde, erkek ve kadından elde edilmiş karışık ve/veya ayrıştırılamayan örneklerin çözümü mümkün hâle gelmiştir. Y kromozomu babadan oğula aktarılır, dolayısıyla baba taraflı akraba olan erkeklerin tespitinde yardımcı olur. Sally Hemmings vakasında Amerikan başkanlarından Thomas Jefferson'un bir kölesinden çocuk sahibi olmuş olduğu göstermek için Y-STR analizi analizi kullanılmıştır.
Mitokondri analizi
Çok bozunmuş DNA örneklerinde CODISTe bulunan 13 STR'sinin tam bir profilini elde etmek bazen imkânsız olabilir. Bu tür durumlarda mitokondriyal DNA (mtDNA) tiplemesi yapılır çünkü hücreden mtDNA'nın pekçok kopyası vardır, oysa çekirdek DNA'sının 1-2 kopyası bulunur. Adlî bilimciler mtDNA'nın HV1 ve HV2 bölgelerini PCR ile çoğaltırlar, bu bölgeleri dizilerler, sonra tek nükleotit farklılıkları bir referans diziyle karşılaştırırlar. Mitokondriyal DNA anneden kalıtıldığı için birbiriyle doğrudan anne bağlantılı akrabalar eşleştirme referansı olarak kullanılabilir; örneğin birisinin anneannesinin kızının oğlu aynı mtDNA'ya sahiptir. Bir veya iki nükleotitlik bir fark, bir şüpheliyi dışlamak için yeterli sayılır. Heteroplazmi ve poli-C farklılıkları dizilerin doğrudan karşılaştırılmasını yanıltabilir, bu yüzden analistin belli bir uzmanlık seviyesinde olması gerekir. mtDNA kesin kimlik tespiti gereken durumlarda yararlıdır, örneğin anne tarafından bir akraba bulunabilen kayıp kişi vakalarında. mtDNA testi kullanılarak Anna Anderson'un iddia ettiği gibi Rus prensesi Anastia Romanov olmadığı belirlenebilmiştir. mtDNA, saçlardan ve eski kemik ve dişlerden elde edilebilir.
DNA veritabanları
Dünyanın çeşitli ülkelerinde DNA veritabanları bulunmaktadır. Bazıları özeldir aittir ama en büyük veritabanları devlet kontrolündedir. ABD, Birleşik DNA İndex Sistemi'ndeki (Combined DNA Index System) 5 milyondan fazla (2007'de) kayıt ile en büyük DNA veritabanına sahiptir. Birleşik Krallık'taki Millî DNA Veritabanı (National DNA Database veya NDNAD) benzer büyüklüktedir. Bu ülkede polisin DNA örnekleri elde etmek ve suçsuz bulunma durumunda dahi onları saklamakta geniş yetkileri vardır. Bu veri tabanının büyüklüğü ve büyüme hızı, kişisel özgürlük savunucusu gruplarca bir sorun olarak görülmektedir. ABD'deki U.S. Patriot Yasası başka ülkelere ait kuruluşlarda çalışan kişilerden DNA örnekleri alma hakkı vermektedir.
Bir suç mahalinde elde edilen örnek Millî DNA veritabanı'ndaki bir kayıtla uyuşursa, bu bulgu ilgili polis kuruluşuna bir ipucu olarak bildirilir. Ancak bu tür bir eşleşmenin mahkemedeki delil değeri düşük sayılır, veritabanından olmayan bir örnekle olan eşleşmeye kıyasla.
DNA delilini değerlendirmedeki faktörler
Adlî delil olarak genetik parmakizlemesinin kullanıldığı ilk yıllarda savunma avukatları, jüriler üzerinde oldukça etkili olan şu tip argümanlar yapardı: 5 milyonda birlik bir tesadüfi eşleşme olasılığı varsa 60 milyon nüfuslu bir ülkede bu DNA profiline uyan 12 kişi vardır; o halde, sanığın suçlu olma olasılığı 12'de birdir. Oysa bu argümanın geçerli olması için sanığın ülkedeki toplumdan rastgele seçilmiş olması gerekir. Jürinin düşünmesi gereken, bu DNA profiline uyan bir kişinin aynı zamanda başka nedenlerden dolayı davada bir şüpheli olma olasılığının ne olduğudur. Bir diğer aldatıcı istatistik argüman, bir kayıtlarla eşleşme için 5 milyonda birlik bir olasılık ile, suçsuz olma olasılığı için 5 milyonda birlik bir olasılığına karşılık geldiği varsayımına dayalıdır, bu argüman savcılık safsatası olarak bilinir.
RFLP kullanıldığında tesadüfi bir eşleşmenin teorik riski 100 milyarda bir, ama pratik risk binde bir olabilir çünkü eşyumurta ikizleri insan toplulukların %0,2'sini oluşturur. Üstelik, laboratuvarda teknik hata yapılması olasılığı muhtemelen daha yüksektir ve çoğu zaman laboratuvar yöntemleri, tesadüfî eşleşme olasılıklarının hesaplanmasında kullanılan varsayımlara karşılık gelmez. Örneğin, tesadüf olasılıkları hesaplanırken iki örneğin jeldeki bantlarının tam tamına aynı konumda olduğu esasına dayanılır, oysa bir laboratuvar teknisyeni benzer -ama tam tamına aynı olmayan- bantların jeldeki bir bozukluk yüzünden aynı olduğu hükmüne varabilir. Oysa, bu durumda, teknisyen eşleşme kriterini genişletmiş olduğu için tesadüf riski artmıştır. Yapılan bazı araştırmalar laboratuvar hata oranlarının göreli olarak yüksek bulmuştur. Genetik parmakizlemesinde, bir eşleşme olasılığını doğru olarak hesaplamak için gerekli olan topluluk verileri her zaman mevcut değildi. 1992 ile 1996 arasında, RFLP analizinde kullanılan eşleşme olasılıkları için teorik olarak hesaplanmış sınırlar yerine, keyfî olarak belirlenmiş daha düşük sınırların belirlenmesi tartışma yaratmıştır. Günümüzde, daha iyi ayırdedici, hassas ve kolay tekniklerin gelişmesi sonucu artık RFLP yöntemi yaygınlığını kaybetmiştir.
STR'ler bu tür sübjektiflik sorunu yaratmaz ve benzer bir ayırdetme gücü sağlarlar (akraba olamayan kişilerde 10^13'te bir tesadüf olasılığı, eğer tam SGM+ profili kullanılırsa). Ancak, Birleşik Krallık'taki bilim adamları bu mertebede olasılıkların istatistiksel olarak kabul edilemez olduğunu, DNA profili aynen uyuşan akraba olmayan kişilerde tesadüf olasılığını milyarda bir olduğunu savunmuşlardır. 1998'ten beri Birleşik Krallık'taki Millî DNA Veritabanı'nda kullanılan DNA profilleme sistemi SGM+'dır, bu sistem 10 STR bölgesi ve bir cinsiyet belirleyici test içerir. Ancak, hangi DNA tekniği kullanılırsa kullanılsın, tedbirli bir jüri üyesi sanığı suçlu bulmakta sadece genetik parmakizlemesi sonucunu kullanmamalıdır, eğer şüphe doğurucu başka kanıtlar bulunuyorsa. Hatalı DNA profili çıkmasının başlıca nedeni laboratuvarda başka delil numuneleri ile kontaminasyondur, bu yüzde favori savunma tekniklerinden biri, numunenin kasıtlı olarak kirletilmiş olabileceği hakkında şüphe yaratmaktır. Daha ender olarak, kimerizm, genetik eşleşme olmaması yüzünden şüpheli bir kişinin haksız olarak dışlanmasına neden olabilir.
Genetik ilişki delili olarak
DNA profillemesini genetik ilişki delili olarak kullanmak mümkündür. Ancak, olumsuz sonuçların mutlak anlamda kesin olmayabileceği testlerle gösterilmiştir. Çoğu kişide tek bir gen grubu bulunmakla beraber, "kimera" olarak adlandırılan bazı ender kişilerde iki farklı gen grubu olabilmektedir. DNA profillemesi ile bir annenin çocukları ile akraba olmadığını hatalı şekilde gösteren çeşitli vakalar bilinmektedir.
Sahte DNA delili
Bazı suçluların suç yerine sahte DNA örnekleri yerleştirdiği vakalar, DNA kanıtlarına ne derece değer verilmesi gerektiğini gündeme getirmiştir. Bir vakada, suçlu kendi vücuduna sahte DNA delili yerleştirmiştir: Dr. John Schneeberger 1992'de anestezi altında olan bir hastasının ırzına geçmiş ve onun iç çamaşırında meni bırakmıştır. Polis üç ayrı seferde Schneeberger'in kanını alıp kandaki DNA ile suç yerinde menideki DNA ile kıyaslamış, ve DNA profillerinde bir aynılık bulmamıştır. Sonunda ortaya çıkmıştır ki, Schneeberger kolunun içine bir Penrose dreni yerleştirmiş, onun için başkasının kanı ve antikogulanlarla doldurmuştur.
Herhangi bir DNA profili ile çakışacak DNA'yı standart moleküler biyoloji teknikleri kullanarak laboratuvarda sentezlemek mümkündür, bunun için birisinden DNA elde etmek gerekli değildir. Hâlen kullanılan adlî prosedürler suni ve doğal DNA'yı ayırdetmemektedir ama bunu yapacak teknikler üzerinde çalışılmaktadır.
Genetik
-
İnsanlarda Kaç Kromozom Vardır?
-
Sık görülen mikrodelesyon sendromları nelerdir?
-
Bilim insanları kromozomları nasıl inceler?
-
Arkea'da Kromozomlar ve DNA Replikasyonu
-
DNA Onarım Mekanizmaları Nelerdir?
-
DNA hasarına neden olan etkenler nelerdir?
-
XYY Süper Erkek Sendromu - JACOB’S, Sendromu
-
Bitki doku kültürü çalışmaları ile haploid bitkiler elde edilebilir
-
Gram pozitif bakterilerden genomik DNA izolasyon protokolü
-
E. coli bakterisinden genomik DNA izolasyon protokolü
-
DNA’nın Keşfi
-
İnsan Genom Projesi Nedir ? Amaçları Nelerdir ?
-
Genomik mikrodizilimlerle ikilenme teşhisi yöntemi
-
Gen duplikasyonu ve amplifikasyonu nedir?
-
DNA ile RNA Arasndaki Farklar ve Benzerlikler Nelerdir