HİSTOLOJİ LABORATUVARI TEMEL BOYAMA YÖNTEMLERİ
Boyanmamış preperatlarda çoğu doku elemanları renksizdirler. Değişik kırma indeksine sahip olmaları nedeniyle ışık mikroskobu ile hücresel detayı görmek güçtür. Farklı morfolojik kısımların, farklı boyalarla boyanması gereklidir. Bu durumda çekirdek sitoplazmadan, kas bağ dokusundan farklı boyanarak, morfolojik inceleme kolaylaşır. Boyalar histokimyasal işlemlerle, dokuların kimyasal reaksiyonlarını ortaya koyar.
Histolojik Boyamanın Kimyasal Temeli:
Genel olarak kesitler iki boya ile boyanırlar. Bazik ve asit boyalarla boyanan kesitleri mikroskop altında incelediğinde bazik ve asit boyaların bazı doku elemanlarını boyadıkları görülür. Bazik boya ile boyanan doku elemanları "bazofilik'' asit boya ile boyananlar ise "asidofilik" olarak adlandırılırlar. Bazı doku elemanları bazik, bazıları ise asit boyaları tutmaktadır. Genel olarak kullanılan bazik boyalar doku elemanları ile mavi-mor, asit boyalar ise pembe-kırmızı renk verirler.
Boyalar sulu bir solusyon içinde anyon ve katyonlara ayrılırlar. Boyaların renk verme kabiliyeti, anyon ve katyonlardaki boya taşıyan organik gruplara bağlıdır. Eğer boya taşıyan grup katyonda ise boya bazik (katyonik) , anyonda ise asit ( anyonik) bir boyadır.
Boyaların doku elemanlarına bağlanma mekanizması genel olarak şöyledir: Doku kesitlerindeki protein, lipoprotein ve glikoproteinler amphoteric' tirler. Yani pH'ya ve çevrelerindeki çeşitli diğer şartlara bağlı olarak iyonize olabilirler. Bir protein,sahip olduğu elektrik yüküne ve boyanmanın meydana geldiği pH' da geldiği ( - ) ve (+ ) yüklerin cebirsel toplamına bağlı olarak asit veya baz olarak hareket eder. Bu her iki tür proteinin (-) ve (+) yük sayılarının eşit olduğu bir pH vardır. Bu pH' ya o proteinin "izoelektrik noktası'' denir. Bu pH'da o protein çok az boyanır. Fakat izoelektrik noktanın üstünde proteinin anyonik gruplarının iyonizasyonu kolaylaşır ve protein, metilen mavisi veya bazik fuksin gibi bazik boyalara bağlanır. Bu izoelektrik noktasının altında, aynı protein, pozitif yüke sabiptir ve bu durumda eosin, orange G veya light green gibi asidik ( anyonik) boyalarla birleşirler. Dokulardaki proteinlerin amino asitleri nisbi miktar bakımından oldukça farklıdırlar ve farklı izoelektrik noktalarına sahiptirler. Dolayısıyla histolojik boyama için kullanılan mutat pH' da, bazı elemanlar daha çok bazik boyaları alarak bazofilik, bazıları ise aynı pH' da asit boyalarla asidofilik olarak boyanır. Eritrositler, eosinofilik lökositlerin granülleri ve midedeki parietal hücrelerin sitoplazmaları pH 6' da asit boyalarla boyanırlar. Buna karşılık çekirdek kromatini sinir hücrelerinin sitoplazmaları ve kıkırdak dokusunun ara maddesi ise bütün bazik boyalarla boyanmaktadır. Dokuları boyamak için ilk girişim, Leuwenhoek(l7l9) tarafından safran kullanılarak yapılmıştır. Bu girişim başarılı olmadığı gibi diğer araştırıcılar tarafından da takip edilmemiştir.
l9. yüzyıl ortalarında dokuların mikroskobik yapıları ayrıntılı olarak açıklanmaya başlanmıştır (Kölliker, l852). Bu dönemde boya endüstrisi gelişmiştir. Histolojide ticari boyaların uygulanması, önceden görülemeyen hücresel yapı detaylarını saptamayı, görülmesini ve çalışılmasını sağlamıştır. Boya teknikleri son yüzyılın ikinci yarısında gelişmiştir ve birçok yöntem o zamandan beri çok az değişikliğe uğramıştır. İki botanikçi ilk kez Carmin boyama yöntemini tanıtmışlardır ancak bu yöntemle sadece dokuların hafifçe renklenmesini sağlayabilmişlerdir. Seçici çekirdek boyamasının ilk kullanımının, sinir hücrelerini boyamaya çalışan Gerlach (l858) tarafından yapıldığı kabul edilmektedir. Başlangıçtaki başarısızlıktan sonra potasyum bikromatta sertleştirilen bir cerebellum kesiti yanlışlıkla fazlasıyla seyreltik amonyaklı carmin solusyonunda bırakılmış ve 24 saat sonra bulunduğunda çok güzel boyanmış olduğu, sinir fibrilleri ve sinir hücrelerinin ayrılabildiği görülmüştür. Gerlach aynı zamanda zayıf asetik asitle differansiyasyonla gerileyen (çekinik) boyanmayı da keşfetmiştir. Hematoksilen ilk kez yetersiz sulu ekstrak olarak kullanılmıştır. Fakat iki yıl sonra Böhmer (l865), hematoksileni bir mordant olarak alumla (şapla) karıştırmıştır ve daha spesifik boyanma elde etmiştir.
Endüstriyel kullanım için anilin boyalar geliştirildikten sonra bu boyalar, hematoksilenle birlikte hala histolojide çok yaygın kullanılmaktadır. Eski boya yöntemlerinin büyük bölümü hala kullanılmaktadır. Carmin , histolojide daha az kullanılmakla beraber, zoologlar tarafından günümüzde bütün haldeki cestodlar, medusalar vs gibi hayvanların boyanmasında kullanllmaktadır.
Günümüzdeki boyama yöntemleri genellikle klasik yöntemlerin modifikasyonlarıdır. Son yöntemler genellikle spesifik kimyasal yapıların ve enzimlerin tayini için renkli reaksiyonlar veren histokimyasal yöntemlerdir.
Histologlarca kullanılan temel boyama teknikleri aşagıdaki tabloda verilmiştir.
Tablo :Histolojide Kullanılan Boyama Süreçlerinin Esas Tipleri
BOYAMA YÖNTEMİ BELİRLEDİĞİ YAPILAR NEREDE NE İLE
1- Vital Boyama
a-partiküllerin Makrofaj sistemi. canlı dokular trypan mavis
fagositozu
b-canlı yapıların Mitokondri canlı hücreler Janus green
spesifik boyanması
2- Seçilen Çözünebilirlik yağ damlacıkları dondurma kesitler Sudan boyaları gibi lizokromlar
3- Renkli kimyasal madde-
lerin yapımı
a-Stabil bileşikler Ferrik demir tüm kesitler Perls' yöntemi
b-Stabil olmayan bi- Enzimler özel hazırlanmış kesitler Histokimyasal Yön.
4 -Metal Çöktürme
a-Intrasellüler yapılar Melanin tüm kesitler Fontana gümüş
b-Fibriller Reticulin tüm kesitler Gümüş yöntemi
5- Boyalarla Boyama
a-Genel kimyasal ve Doku yapıları tüm kesitler H+E
fiziksel hareketler
b-Metakromazi kıkırdak, amyloid " " Thionin, crystal violet
c-Bir boyanın lokal DNA parafin kesit Feulgen reak.
Şekillenmesi
Enzim histokimyasından, gumüş çöktürme yöntemine kadar tüm yöntemlerin fizikokimyasal temelleri aynıdır. Bütün boyama yöntemlerinde sorulacak en önemli sorular şunlardır:
a-Doku kompenentleri neden boyanır?
b-Neden boyanmış kompenentler boyalı olarak kalırlar?
c-Neden tüm kompenentler boyanmazlar?
Histoloji Laboratuvarı
-
Glasiyal asetik asit (CH3COOH) nerelerde kullanılır? nasıl hazırlanır ?
-
Formaldehit özellikleri nelerdir? nasıl hazırlanır
-
Histoloji Preperatların Etiketlenmesi
-
DONDURMA YÖNTEMİ
-
Histoloji Preparatı Kesit alma işlemi
-
HİSTOLOJİ PREPARATLARININ LAM ÜZERİNE YAPIŞTIRILMASI
-
PARAFİN KESİTLERİN HAZIRLANMASI
-
TEMELİNDE SUBLİME VE KARIŞIMLARI BULUNAN TESPİT SOLUSYONLARI
-
TEMELİNDE PİKRİK ASİT BULUNAN TESPİT SOLUSYONLARI
-
TEMELİNDE DİKROMAT BULUNAN TESPİT SOLUSYONLARI
-
ETİL ALKOL BULUNAN TESPİT SOLUSYONLARI
-
FORMALDEHİTLİ TESPİT SOLÜSYONLARI
-
İyi bir fiksatifte aranan nitelikler
-
Fiksatif seçimi ve süresi
-
E- MASERASYON YÖNTEMİ