Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analizi
Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analizi restriksiyon endonükleazların çift iplikli DNA’yı spesifik tanıma bölgelerinden kesmesi temeline dayanmaktadır.
Endonükleazlar bakteriler tarafından bakteriyofaj infeksiyonuna karşı savunma amacıyla üretilirler. Bu enzimler bakteriyofaj DNA’sını tanıyıp parçalarken bakterinin kendi DNA’sına zarar vermezler. Her bir restriksiyon endonükleaz spesifik palendromik kısa DNA dizisini tanır ve keser. PCR ile çoğaltılan DNA bölgesi restriksiyon enziminin kesimine tabi tutulur. Oluşan DNA fragmentleri jel elektroforezi ile fragment büyüklüklerine göre ayrılırlar. DNA mutasyonları enzimin kesme noktasını ortadan kaldırabilir veya yeni bir enzim kesme noktası oluşturabilir, böylelikle kesim sonucu oluşan fragment sayısını değiştirirler. Restriksiyon bölgeleri arasındaki insersiyon veya delesyon mutasyonları da fragment büyüklüklerini değiştirirler. Genomda kodlama yapan ve yapmayan bölgelerde restriksiyon enzim tanıma bölgelerinin dağılımı insanlar arasında farklıdır. Bu farklılıklar doğal genomik çeşitliliği yansıtır ve genellikle fenotipik bir sonucu olmayan RFLP’leri oluşturur. Bunun yanında RFLP analizleri genetik hastalıkların association ve linkage çalışmalarında sıkça kullanılmaktadır. Hastalıkla ilişkilendirilen aday gendeki RFLP’ler, etkilenmiş bireyler ve kontroller arasındaki allel frekansları dikkate alınarak ilgili mutasyon ve genin hastalıkla ilişkisini ortaya koymada oldukça kullanışlı bilgi vermektedir.
Kesim ürünlerinin poliakrilamid jel elektroforezi
Hazırlanan jelin elektroforezi için dikey elektroforez cihazı kullanılır. Jelin kalınlığı 0.5 mm olarak ayarlanır. Yüzde sekizlik non denatüre PAGE stok solüsyonuna sırası ile % 10’luk APS stoğundan %1 hacim ve TEMED’den %0.1 hacim ilave edilip 0.5 mm’lik cam aralığına dökülür. Polimerizasyonun tamamlanması için en az 1/2 saat beklenir.
Polimerizasyon sonrası camlar elektroforez cihazına yerleştirilir, 1X TBE içeren yürütme tamponu ilave edilip örnekler jel kuyucuklarına yüklenir. Yükleme tamponu içinde bulunan ve elektrik alanda hareket eden DNA brom fenol mavisi ve ksilen siyanol boyaları yardımıyla jel üzerinde takip edilir.