Apoptoz’un Belirlenmesinde Kullanılan Biyokimyasal Yöntemler
1.Agaroz Jel Elektroforezi: DNA kırıklarının gösterilebildiği bir başka yöntemdir. Apoptozisde DNA, 180 baz çifti ve bunun katlarına karşılık gelen noktalardan (internukleozomal bölgelerden) kırıldığı için merdiven görüntüsü “ladder pattern” oluşur. Bu bulgu apoptozisin karakteristik özelliğidir ve nekrozisde görülmez. O yüzden apoptozisi nekrozisden ayırmada faydalı yöntemlerden biridir.
2. “Western” Blotting Bu metod yardımıyla apoptozise özgü bazı proteinlerin eksprese olup olmadıklarının (örn. bcl-2) ya da kırılıp kırılmadıklarının (örn. kaspaz-3) saptanması mümkündür. Sitokrom c’nin mitokondriye çıkıp çıkmadığının belirlenmesi de bu metodla belirlenebilir. Yanlız, sitokrom c tespitinde önce alt-fraksiyonlama yapılarak hücrelerin mitokondriyal ve sitoplazmik fraksiyonları ayrılır. Ardından, normalde sitoplazmik fraksiyonda bulunması beklenmeyen sitokrom c’nin bu fraksiyonda tespit edilmesi halinde hücrelerin apoptozise gittikleri anlaşılır.
3. “Flow” Sitometri “Flow” sitometri yardımıyla floresan bir madde ile işaretlenmiş antikor kullanılarak apoptozisde eksprese olduğu bilinen her hangi bir hücre yüzey proteininin saptanması mümkündür. Böylece apoptotik hücreler belirlenebilir. Kolay uygulanabilir olması, aşırı uzun zaman almaması ve kantitatif sonuç verebilmesi açısından klinikte apoptozis deteksiyonu açısından kullanışlıdır. Özellikle iki şekilde apoptozis deteksiyonu yapılır. a. floresan bir madde olan propidium iyodür kullanılırak, b. Anneksin V kullanılarak. Birincisinde, kompleks bilgisayar işlemlerinin kullanılarak hücre boyutu ile içerdiği DNA miktarının kıyaslanarak, azalan DNA miktarının apoptozis lehine olduğu gerçeğinden hareketle, apoptotik hücre populasyonu (sub-G1 piki) tayin edilir. İkincisinde, floresan mikroskobuyla uzun zaman alan sayma işlemi saniyeler içinde yapılarak sonuç alınır. “Flow” sitometri grafiklerinde sağ-alt kadrandaki populasyon anneksin V’in pozitif ve propidium iodid’in negatif olduğu apoptotik hücrelerin bulunduğu bölgedir.
Kaynak:
http://biyokimya.uludag.edu.tr/apoptozis_ders_notu.pdf
Dr. Engin ULUKAYA Biyokimya Anabilim Dal
Genel Biyoloji
-
Protista Alemi ve Genel Özellikleri
-
Hücrelerdeki farklı ve benzer yapılar
-
Ses Nedir ? Ses Nasıl Oluşur?
-
Kültürü Yapılan Fitoplankton Türleri Nelerdir?
-
Apoptoz: Programlı Hücre Ölümü Nedir?
-
Ribozom ve Protein Sentezi
-
Mikrotübüller ve İplikçikler
-
Hücre Zarları
-
Lipid Çift-Katmanın Keşfi
-
Biyoreaktör
-
Telomerler ve İnsan Telomerinin Kristalik Yapısı
-
Hücre Biyolojisinin Tarihsel Gelişimi
-
Hücre biyolojisi nedir ?
-
Biyolojik Çeşitlilik Nedir ?
-
Sinir Sistemi Yapısında Bulunan Hücre Tipleri ve Özellikleri Nelerdir?
