Apoptoz’un Belirlenmesinde Kullanılan Yöntemler

Apoptozisi saptamak için çok çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. 1972 yılında, apoptozis terimi ilk kez kullanıldığında hücrenin morfolojik görünümüne göre karar verilmişti.

Oysa, günümüzde morfolojik değerlendirmenin yanısıra apoptozise özgü olduğu bilinen bazı aktivasyonların (örn. aktif kaspaz-3 tayini) moleküler düzeyde belirlenmesiyle de saptanabilmektedir.
İlk kez morfolojik kriterlere göre belirlenen apoptozis, 80’li yılların sonuna doğru DNA kırıklarının oluştuğunun ortaya çıkarılmasıyla birlikte bu kırıkların saptanmasına yönelik yöntemlerle belirlenmeye başlandı. 90’ların ortalarında ise apoptotik hücrelerde kaspazların aktifleştiği bulundu. Böylece, kaspaz aktivasyonlarının belirlenmesine yönelik metodlarla saptanabilen apoptozis, 90’ların sonuna doğru fosfatidilserin translokasyonunu belirleyen yöntemlerle de saptanmaya başlandı. Apoptozisin belirlenmesine yönelik geliştirilen tüm metodları, 2000’li yılların başlarında, sadece apoptotik epitelyal hücrelerde olmak üzere kaspaz aktivitesiyle kırılan bir protein olan keratin 18’in kırıldıkdan sonraki özgün formunu saptayan antikorların kullanılarak daha spesifik olarak saptanması takip etti.
Apoptozisin belirlenmesinde kullanılan yöntemler aşağıda sıralanmıştır:
1. Morfolojik görüntüleme yöntemleri
2. İmmunohistokimyasal yöntemler
3. Biyokimyasal yöntemler
4. İmmunolojik yöntemler
5. Moleküler biyoloji yöntemleri
Fakat, bu sınıflama çeşitli şekillerde yapılabilir. Yani, yöntem türünden ziyade apoptozise özgü herhangi bir hücresel olayın / aktivitenin belirlenmesi esas alınarak değerlendirme yapılabilir. Örneğin, apoptozis DNA fragmentasyonu esas alınarak saptanacaksa o zaman yukarıda sıralanan metodların bir veya birden fazlası kullanılabilir. Çünkü, DNA fragmentasyonu histokimyasal olarak gösterilebileceği gibi, biyokimyasal olarak da gösterilebilir. Hatta, ELISA ile de gösterilebilir. Bu ayrımda önemli olan çalışılacak numunenin cinsidir. Hücre kültürü yapılarak elde edilen bir numune ise, biyokimyasal bir yöntem olan agaroz jel elektroforezi yapılabilir. Eğer bir dokudaki DNA fragmentasyonları (apoptotik hücreler) araştırılıyorsa o zaman da histokimyasal bir yöntem olan TUNEL yöntemi kullanılabilir.
Apoptozis herhangi bir metodla tespit edildikten sonra bir başka metodla da doğrulanmalıdır. Aksi takdirde, yapılan çalışmanın temel bilim araştırmalarının yayımlandığı uluslararası dergilerde yayımlanma şansı ya hiç yoktur ya da azdır. Klinik bilim dergilerinde bu şans daha fazla olabilir.

1. Morfolojik görüntüleme yöntemleri

1. Işık Mikroskobu
a. Hematoksilen Boyama
b. Giemsa Boyama
2. Floresan Mikroskobu / Lazerli Konfokal Mikroskop
a. Propidium İyodür (PI)
b. Hoechst Dye
3. Elektron Mikroskobu
4. Faz Kontrast Mikroskobu

2. İmmunohistokimyasal yöntemler

1. Anneksin V Yöntemi
2. TUNEL Yöntemi
3. M30 Yöntemi
4. Kaspaz-3 Yöntemi

3. Biyokimyasal yöntemler

1. Agaroz Jel Elektroforezi
- DNA fragmentasyonu
2. “Western Blotting”
- Substrat kırılmaları
- Aktif kaspaz’ın belirlenmesi
- Sitokrom c salıverilmesi
3. “Flow” Sitometri

4. İmmunolojik yöntemler

1. ELISA
- DNA Fragmentasyonu
- M30 Düzeyi
2. Fluorimetrik Yöntem
- Kaspaz Aktivasyonu

5. Moleküler biyoloji yöntemleri
- DNA Microarrays

Kaynaklar:

1 - http://cu.dergipark.gov.tr/download/article-file/25371R* Arş. Gör. Gülfidan COŞKUN* Yrd.Doç.Dr. Hülya ÖZGÜ

2- http://biyokimya.uludag.edu.tr/apoptozis_ders_notu.pdf Dr. Engin ULUKAYA Biyokimya Anabilim Dalı

#apoptoz’un #belirlenmesinde #kullanılan #yöntemler