Blotlama Teknikleri Nelerdir ? - Blotting
Blotlama (blotting) terimi, biyolojik örneklerin bir jelden bir membrana aktarılmasını ve bunların membran yüzeyinde daha sonraki tespitini ifade eder.
Hücrenin önemli molekülleri olan DNA, RNA ve proteinlerin kompleks bir karışımdan tespit edilmesini sağlayan bir tekniktir.
Blotlama tekniklerinin üç tipi vardır.
Blotlama Tekniği |
İlgilendiği Molekül |
|
DNA |
|
RNA |
|
PROTEİN |
Her blotlama tekniğinin kendi özgü çalışma prensibi vardır. Bu teknikler, bahsedilen makromoleküllerin ''görselleştirilmesi'' için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yazıda, her bir blotlama tekniğinin temel prensibine, prosedürüne ve uygulamalarına yer verilmiştir.
- SOUTHERN BLOTLAMA
Edwin Southern tarafından 1973'te geliştirilen ve hala kullanılan bu moleküler biyoloji tekniği, DNA'nın yapısını incelemek amacıyla kullanılmaktadır. Diğer birçok DNA molekülleri arasından spesifik DNA molekülünü tespit eder ve bu spesifik sekansı tanımlamak için bir organizmanın toplam DNA'sını (genomunu) analiz eder.
- Prosedür
- İlk olarak genomik DNA, bir restriksiyon endonükleazıyla küçük parçalara bölerek hazırlanır.
- DNA fragmentleri jel elektroforeziyle boyutlarına göre ayrılır.
- Çift iplikli DNA parçaları jel içinde tek iplikçikler halinde denatüre edilir.
- DNA jelden bir blotlama membranına (nitroselüloz ya da naylon filtre) aktarılır. (Bu adım tekniğe "Southern Blottng" adını veren adım olsa da, terim tipik olarak tüm prosedürü açıklamak için kullanılmaktadır).
- Aktarım tamamlandıktan sonra, zar tüm bantları orijinal olarak jel üzerinde taşır.
- Zar daha sonra numunede belirli bir DNA sekansına tamamlayıcı bir sekansa sahip olacak şekilde tasarlanan bir prob olarak adlandırılan küçük bir DNA veya RNA parçası ile muamele edilir. Bu, probun zar üzerindeki spesifik bir DNA fragmanıyla hibridizasyonu sağlanır.
- Son olarak, hibridizasyonun ardından tipik bir radyoaktif atom veya bir floresan boya ile işaretlenir. Böylelikle ilgili DNA fragmanının zar üzerindeki birçok farklı DNA fragmanı arasından tespit edilmesine izin verir.
Şekil 1 : Southern Blot Tekniği
- Uygulamaları
- Verilen örnekte DNA'yı tespit etmek.
- DNA parmak izi, bir southern blotlama örneğidir.
- Babalık testi, suçlu tanımlama.
- İlgili bir geni izole etmek ve tanımlamak.
- Restriksiyon fragment uzunluğu polimorfizmi.
- DNA dizisindeki bir mutasyonu veya gen düzenlenmesini tanımlamak.
- Genetik bozuklukların neden olduğu hastalıkların tanısı.
- Enfeksiyöz ajanları tanımlamak.
- NORTHERN BLOTLAMA
Northern blotlama tekniği 1977'de Stanford Üniversitesi'nde James Alwine, David Kemp ve George Stank tarafından geliştirilmiştir. Tekniğin adı, Southern blotlama işleminin benzerliğinden kaynaklanmakla birlikte bu teknik sadece RNA ile ilgilenir. Southern blotlamadan en önemli farkı budur. Gen ekspresyonu çalışmaları için kullanılan bir tekniktir. Belirli RNA (veya izole edilmiş mRNA) saptanması amacıyla uygulanır.
- Prosedür
- Toplanan doku veya kültür örnekleri önce homojenleştirilir. Örnekler, karşılaştırma için farklı kültür tiplerini temsil edebilir veya kültür içindeki farklı büyüme aşamaları için olabilir.
- RNA dizisi elektroforez ile ayrılır ve nükleik asit ayrımı amacıyla agaroz jel kullanılır.
- Ayrılmış RNA dizisi naylon membrana aktarılır. Bu, kılcal eylem ve iyonik etkileşim olarak adlandırılan iki mekanizmayla yapılır.
- Transfer işlemi, şu sırayla yapılır : İlk olarak, agaroz jel yığının alt tarafına yerleştirilir, ardından blotting membran gelir. Kağıt havluların üstüne hafif bir ağırlık (cam levha) yerleştirilir. Tüm kurulum, transfer tamponu içeren bir beherde tutulur.
- Naylon membrana aktarılan RNA daha sonra UV radyasyonu kullanılarak sabitlenir.
- Sabit naylon membran daha sonra ilgili gen için özel olarak tasarlanmış problarla karıştırılır. Böylece ilgilenilen diziye karşılık gelen blot üzerinde RNA dizileri ile hibridize olur.
- Blot membranı istenmeyen probun uzaklaştırılması çin yıkanır.
- İşaretli prob, otoradyografi ile tespit edilir. X ışını filminde karanlık bantlar şekildinde gözlemlenir.
Şekil 2 : Northern Blot Tekniği
- Uygulamaları
- Belirli genin kimliğini, sayısını, etkinliğini ve boyutunun gösterilmesi.
- Bir doku veya organizmanın büyümesi için kullanılabilir.
- Farklılaşma ve morfojenezin farklı aşamalarında değişen RNA miktarının tespit edilmesi.
- Anormal, hastalıklı veya enfekte durumların moleküler düzeyde tanımlanmasına yardımcı olur.
ÖRNEK :
Northern blotlama ile mRNA seviyeleri karşılaştırılabilir. Bu jel görüntüsü, bir hücre örneğindeki ekspresyondan sonra çeşitli aralıklarla mRNA düzeylerinin izlenmesini göstermektedir. İlk 15 dakikadan sonra mRNA seviyeleri düşükken, 2 saat sonra bu seviyelerin arttığı gözlemlenmiştir.
- WESTERN BLOTLAMA
Towbin ve ark. Tarafından 1979'da açıklanmıştır. Protein analizi için kullanılan rutin bir tekniktir. Antijeni spesifik olarak saptamak için bir antikor kullanıldığından ''immünoblotlama'' olarak da adlandırılır. Antikorlar çok az miktarda proteinin fare, tavşan, koyun (polyklonal antikorlar) veya hücre kültürlerine (monoklonal antikorlar) enjekte edilmesi sonucu hücreler tarafından üretilen biyolojik moleküllerdir ve moleküler biyolojide birçok teknik ve analizde etkili bir şekilde kullanılmaktadır.
Antikor-antijen etkileşiminin özgüllüğü, bir kompleks protein karışımının ortasında bir hedef proteinin tanımlanmasını sağlar. Western blotlama, ilgili protein hakkında niteliksel ve yarı niceliksel veriler üretebilir.
- Prosedür
- Örnek, SDS-PAGE (Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi)'nin çukuruna yüklenir. Proteinler elektrik yükü, izoelektrik nokta, molekül ağırlığı veya bunların hepsinin kombinasyonu temelinde ayrılır. Küçük boyutlu protein, büyük boy proteinden daha hızlı hareket eder. Protein negatif yüklüdür, bu nedenle elektrik akımı uygulandığında pozitif (anot) kutba doğru hareket ederler
- Ayrılan moleküller, genellikle bir nitroselüloz veya poliviniliden diflorür (PVDF) membranı olmak üzere ikinci bir matris üzerine blotlanır.
- Antikorlar da proteinlerdir, bu yüzden nitroselüloz kağıdı bağlamaları muhtemeldir. Membranın yüzeyine antikorların herhangi bir spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için membran bloke edilir. (BSA (Bovine Serum Albumin) ya da kazein ile).
- Yaygın olarak, transfer edilen protein daha sonra bir antikor kombinasyonu ile incelenir: İlgili proteine spesifik olan bir antikor (birincil antikor) ve birincil antikorun konakçı türüne özgü başka bir antikor (ikincil antikor).
- Genellikle ikincil antikor, uygun bir substratla birleştirildiğinde, saptanabilir bir sinyal üretecek olan bir enzimle kompleks haline getirilir.
- Enzim etkisini görselleştirmek için reaksiyon karışımı, spesifik substrat ile inkübe edilir. Enzim, substratı görünür renkli ürün vermek üzere dönüştürür, böylece membrandaki renk bantı görselleştirilebilir. Western blotting ayrıca örneklemdeki protein miktarını belirlemek için kantitatif bir testtir.
Şekil 3 : Western Blot Tekniği
- Uygulamaları
- Verilen örnekte protein miktarını ve miktarını belirlemek.
- Bazı hastalıkların teşhisi amacıyla serumda virüs veya bakterilere karşı antikoru tespit eder.
- HIV için doğrulayıcı test olup hastanın serumunda anti HIV antikoru tespit eder.
- Defektif proteinleri tespit etmek için kullanışlıdır. Örneğin, Prion hastalığı.
- Creutzfeldt-Jacob hastalığı, Lyme hastalığı, Hepatit B ve Herpes hastalıkların tanısında kullanılır.
Derleyen : Büşra Akyol
ANALİZLER
-
Hemoglobin elektroforezi nedir?
-
Homosistein testi nedir?
-
Hematokrit testi nedir?
-
Analiz - Tahlil Test Kısaltmaları
-
Albumin Testi Nedir ? Ne için Yapılır?
-
Kanda Sodyum Tatini Nasıl Yapılır ? Normal değerleri nelerdir ?
-
Açlık Kan Şekeri Testi (Glukoz) Normal Değeri Nedir ? AKŞ Testi Nasıl yapılır?
-
Aktive Protein C Rezistansı Testi Nedir? Aktive Protein C Rezistansı Ne İçin Yaptırılır
-
Protein S Aktivitesi Testi Nedir? Protein S Aktivitesi Ne İçin Yaptırılır.
-
Protein C Aktivitesi Testi Nedir? Protein C Aktivitesi Ne İçin Yaptırılır.
-
Antitrombin III Testi - Anti-Thrombin III Testi
-
Fibrinojen - Faktör 1 Testi Nedir? Normal Değerleri Nelerdir? Nasıl Yapılır?
-
Trombin Zamanı Testi, TT, Trombin pıhtılaşma zamanı Testi Nedir
-
aPTT Testi - Aktive Parsiyel Tromboplastin Zamanı Testi Nedir ? Nasıl Yapılır ?
-
Protrombin Zamanı Testi Nedir? Nasıl Yapılır ?