Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

Bordetella spp DFA testi

---

Materyal

• Test edilecek izolatın ve pozitif kontrol suşlarının BGA pasajları (37°C'de 3 günlük)
• Pozitif kontrol suşları:
• B.pertussis ATCC 9797
• B.parapertussis ATCC 15311
• Negatif kontrol suşu - Escherichia coli ATCC 25922 (KKA pasajı)
• DFA testi için konjugatlar (FITC bağlanmış, poliklonal, tavuk antiserumu)
• B. pertussis FITC konjugat
• B. parapertussis FITC konjugat
• PBS, pH 7.2
• „mounting medium‟† pH 7.2
• %1 casamino asid
• %0.85 NaCl (SF), steril
• Cam tüp, steril (yeterli sayıda)
• Temiz DFA lamları (yeterli sayıda)
• Petri kabı (ıslak süzgeç kağıdı ile nemli ortam temini için)
• Floresan mikroskop

Prensip
Bu testte bir bilinmeyen izolatın hem B.pertussis hem de B.parapertussis olup olmadığı araştırılır. Bu nedenle her iki tür için standart pozitif kontrol suşlarının ve negatif kontrol bakterisinin her teste alınması gerekir! Cam malzeme ve pipetlerin temiz olmasına ve deterjan kalıntısı içermemesine dikkat edilir!
Test öncesinde tüm kit materyali, 30 dk oda ısısında bekletilir!

Konjugatın hazırlanması

1 Bordetella sp konjugatları liyofilize haldedir. Testlerde kullanılmadan önce sulandırılmalı ve çalışma dilüsyonuna karar verilmelidir.
2 Konjugat kitin talimatnamesine göre uygun dilüent kullanılarak sulandırılır. Yavaşça çevirerek karıştırılır; içeriğin tamamen çözülmesi sağlanmalıdır.
3 Sulandırılmış konjugattan çalışma dilüsyonu hazırlanmalıdır. Çalışma dilüsyonunu bulmak için konjugatın seri dilusyonu (pH 7.2 PBS kullanarak) yapılır.
4 Her bir dilüsyon B.pertussis ve B.parapertussis standart suşları ile ayrı ayrı test edilerek konjugatın titrasyon değeri saptanır. Çalışma dilüsyonu elde etmek için yanda örnek olarak verilen titrasyon tablosu incelenir.
5 Tabloda verilen örnekte, son 4+ floresan 1:40 titrede görülmüştür. Klinik örnekler veya şüpheli izolatların tanımlanmasında testlerde kullanılacak çalışma dilüsyonu olarak –testin güvenli olması açısından- 1:20 dilüsyon yapılmasına karar verilir ve konjugat 1:20 sulandırılır.


DFA lamlarının hazırlanması
DFA lamları taze saf BGA kültürlerinden hazırlanır. Pozitif ve negatif kontrol suşları da test edilecek şüpheli izolatlarla birlikte teste hazırlanır. Test için;
1 Suşların her birinden ~2 mL distile su içinde McFarland No 0.5 veya 1 bulanıklığında bakteri süspansiyonları hazırlayın.
NOT: Pozitif kontrolün dansitesi homolog konjugat ile 4+ floresan verecek şekilde ayarlanmalıdır. Test edilecek kültür izolatlarının yoğunluğunun da pozitif kontrole karşılık gelecek şekilde ayarlanması gereklidir.
2 Bir şüpheli izolatın test edilebilmesi için toplam 6 godeye ihtiyaç vardır (bkz. İekil 6). Her godeye ~30 μL bakteri süspansiyonu olacak şekilde;
(a) test edilecek izolat, lamın ilk iki godesine,
(b) B. pertussis standart suşu 3. godeye,
(c) B. parapertussis standart suşu 4. godeye,
(d) E. coli (negatif kontrol) de son iki godeye konur.
3 Birden fazla şüpheli izolatın test edilmesi durumunda;
(a) 4 godeli bir lam, kontrol suşlarına ayrılır ve bir godeye B. pertussis standart suşu, bir godeye B. parapertussis standart suşu, iki godeye de E.coli (~30 μL) konur.
(b) Diğer lam(lar)a da test edilecek her bir örnekten ikişer godeye ~30‟ar μL konur.
4 Lam(lar) havada kuruttuktan sonra 3 kez alevden geçirilerek fikse edilir.

ÖNEMLİ NOT: Klinik örneklerden B.pertussis veya B.parapertussis'in DFA testi sadece ön tanı konmasında yardımcıdır. Kesin tanı kültür, morfolojik ve serolojik değerlendirmelerin ardından konmalıdır. Yine de laboratuvar klinik örneklere DFA uygulamak isterse, klinik örneklerden yayma hazırlanmasının, koloniden preparat hazırlanmasından farklı olduğu hatırlanmalıdır. Aşağıda verilen yol izlenir:

• Önce nazofaringeal eküvyon 0.5 mL %1‟lik casamino asit solüsyonu içinde homojenize edilir ve en fazla 2 saat olmak üzere 37°C‟da bekletilir.
• Godeleri büyük olan çift godeli bir lamın her iki godesine de homojenattan 30-50 μL alınarak yayılır. Pozitif ve negatif kontroller ayrı lama hazırlanır.
• Lamlar havada kurutulur ve %95‟lik etanol ile sabitlenir.
• Örnek lamlarının her biri ve kontrol lamları kesinlikle ayrı ayrı kaplarda olacak şekilde yıkanmalıdır. Bu nedenle birden fazla tek kullanımlık bardağa PBS konur.

Testin yapılışı

1 Sabitlenmiş lamların her godesine ~30 μL uygun konjugat konur (bkz. İekil 5) ve godeye yayılır. Lam, nemli ortamda (ör., içine ıslak süzgeç kağıdı yerleştirilmiş temiz bir Petri kutusuna yerleştirilerek), oda sıcaklığında 30 dk inkübe edilir.
2 Sonra lamın üzerinden yumuşakça PBS akıtılarak konjugat uzaklaştırılır ve lam 10 dk bir yıkama jarı içindeki PBS‟de bekletilir. İlk 5 dakikayı takiben PBS yenilenir.
3 Ardından, lam 2 dk distile suda bekletilir; havada veya kurutma kağıdı ile kurutulur.
4 Godelere birer damla (~20 μL) „mounting medium‟ damlatılır. Lamel ile kapatılır.
5 Floresan mikroskopta 40× veya 100× objektif ile incelenir. Floresan varlığı açısından değerlendirilir ve derecesi kaydedilir.

Yorum

1 B. pertussis ve B. parapertussis DFA konjugatlarının rutin test dilusyonlarında reaksiyon bu bakterilerin düz (smooth) kolonili homolog kültürleri ile göz alıcı parlaklıkta (4+) ve özgül olmalıdır. Genellikle, heterolog suşlarla çapraz reaksiyon
gözlenmez.
2 Floresan yoğunluğu aşağıda belirtilen özelliklere göre değerlendirilir ve kaydedilir:
        4+ göz alıcı parlak, sarı-yeşil, periferal boyanma, maksimum floresan.
        3+ parlak sarı-yeşil, periferal boyanma
        2+ tam, ancak donuk, sarı-yeşil, periferal boyanma
        1+ zayıf fark edilebilen periferal boyanma
3 Pozitif kontrol, konjugatın çalışma dilüsyonu ile 4+ reaksiyon vermeli.
4 Negatif kontrol, konjugatın çalışma dilüsyonu ile 1+ reaksiyonu aşmamalı.
5 Test yaymalarında en az 2+ floresan, pozitif reaksiyon olarak düşünülmelidir.
6 Pozitif kontrol 3+ reaksiyondan az veya negatif kontrol 1+ reaksiyondan fazla ise:
(a) Konjugat bozulmuş olabilir,
(b) PBS veya „mounting medium‟ pH'sı değişmiş olabilir. Yeni reaktiflerle test tekrarlanmalıdır.

---