DİFFÜZ NEUROENDOKRİN SİSTEM (DNES) HÜCRELERİNİN GÖRÜNTÜLEME TEKNİKLERİ .
Hücreden hücreye çok belirgin farklılıklar göstermeyen DNES hücre granüllerini saptamak zordur. Tek tek dağılan DNES hücreleri yarı spesifik histokimyasal teknikler kullanılarak araştırılabilir. Bu yöntemler sadece granül içermiyen hücrelerden, granül içeren hücreleri ayırt etmek için kullanılmaktadır. Endokrin hücre granülleri kurşun hematoksilen ile boyanabilmektedir. DNES hücre granüllerinin görünümü ve içeriklerine bakarak tanımlama yapılmak istenirse ultrastrüktürel, immunofloresans ve immunoenzim çalışmaları yapılmalıdır. DNES hücre granüllerini incelemek için uygun bir doku hazır¬lama yönteminin seçimi de çok önemlidir.
ULTRASTRÜKTÜREL YÖNTEMLER: E.m. için rutin prosedürden geçirilmiş ve boyanmış materyel kullanarak intraselüler nörosekretuvar granüllerin varlığı veya yokluğu saptanabilir. Granüllerin büyüklüğü, şekil ve densitesi hakkında veya granüllerde halonun bulunup bulunmadığı hakkında bazı bilgiler elde edilebilir.
HİSTOKİMYASAL TEKNİKLER: Aldehit fiksasyonu yapılmış ve parafine gömülmüş materyellerin tamamına en uygun histokimyasal görüntüleme yöntemi, bazik ve metakromatik boyaların, kurşunlu hematoksilen ve argirofil yöntemlerinden birinin kullanıl¬masıdır. Bu yöntemlerden birden fazlası aynı doku üzerine uygulanmalıdır.
a-Bazik ve Metakromatik Boyalar: Metakromatik fluorokromlan içeren bazik ve metakromatik boyalar, polipeptidlerin anyonik karboksil, sülfat ve fosfat grupları ile reaksiyona giren katyonik boyalardır. Bu boyalar aminoasit sıralaması hakkında bilgi vermezler ve spesifik olarak hormonları gösteremezler. Pratikte, metakromatik boyalarla kısmen daha fazla bilgi edinilir. Metakromatik boyaların sekonder protein yapısını gösterdiğine inanılır. Reaksiyon, nükleotidlerde nor¬mal olarak bulunan reaktif grupların asit ile hidrolize edilerek uzaklaştırılması ile geliştirilebilir ve aynı zamanda yan zincir karboksillerini de meydana çıkarır.
Asit İle Hidrolizden Sonra Bazik ve Metakromatik Boyalar
Fiksasyon: Formalin, paraformaldehit, gluteraldehit, Bouin, Helly
Kesitler: Parafin
Azure A çözeltisi: % 0.005'lik distile suda hazırlanmış azure A
Toluidin Blue çözeltisi: 20 mM Mc İvaine tamponu ile pH 5'e tamponlanmış distile sudaki % 0.01 lik Toluidin Blue
Alcian blue çözeltisi:Asetat tamponu ile pH'sı 5 ' e ayarlanmış % 0.1'lik alsian blue
Hidroliz için asit çözeltisi: 0.2 M'lık HCl
Yöntem
1-Kesitleri suya indir
2-Asit hidroliz çözeltisinden (0.2 M) geçirme:
60-65 C’ de 3-4 saat (formalin, paraformaldehit, Bouin ile fikse edilenler)
60-65 C’ de 12 saat (gluteraldehit veya Helly ile tespit edilenler)
3-Suda iyice yıka
4-Aşağıdakilerden biri ile boyayınız.
a- Azure A çözeltisi ile 6 saat
b-Toluidin blue çözeltisi ile 6 saat
c-Alsian blue ile 10 dakika
5-Ya suda çalkalayıp gliserin jelly ile kapatınız ya da kurutma kağıdı ile kurula¬dıktan sonra 1 dakika saf isopropanol ile iyice ıslatın, ksilolde şeffaflandırın ve DPX'le kapatın.
DNES granülleri toluidin blue ve azure A ile menekşe-kırmızı alsian blue ile mavi
AÇIKLAMALAR: Azure A ve toluidin blue yöntemlerinde artan dereceli alkol serilerinde dehidrasyon yapılmaz. Alsian blue yöntemi ile musin granülleri (örnek ince barsak mukozasındakiler) boya¬nacaktır ve DNES granülleri ile karıştırılmamalıdır.
b-Kurşun Hematoksileni
Kurşun hematoksilen tekniği, endokrin hücrelerin boyanması için adapte edil¬miştir. Kurşun hematoksileni, karboksil ve karboksi-amid grupları ile birleşerek bir bazik boya gibi hareket eder. Bağlanmanın sadece heteropolar olmadığı fakat kısmen kurşunun kendinden dolayı olduğuna dair bazı bulgular vardır. Asit ile hidrolize edildikten sonra kullanılırsa daha kuvvetli boyar fakat genellikle hidro¬lize edilmeden kullanılmaktadır.
Fiksasyon: Tercihen formaldehit veya gluteraldehit
Kesitler : Parafin
Stabilize kurşun çözeltisi:
%5' lik su ile hazırlanan kurşun nitrat...... ...50 cc
Suda doyurulmuş ammonium asetat...........50 cc
Filtre edilir ve % 40' lık formaldehitten 2 cc eklenir.
Kurşun hematoksileni boyama çözeltisi
Stabilize kurşun çözeltisi ...........10 cc
% 95' lik etil alkol....................... 1.4 cc
Hematoksilen..............................0.2 g
Distile su.....................................10 cc
Yukardaki sıra ile karıştırıp, çalkalayın. 30 dakika sonra filtre edin ve filtratı 75 cc ye distile su ekleyerek tamamlayın.
Uygulama
Ksilolle parafini uzaklaştırın, artan alkol serilerinden geçirerek suya indirin.
37 C’ de 2-3 saat veya 45 C ' de 1-2 saat kurşun hematoksilen boyama çözeltisi ile boyayın.
Distile suda yıkayın, sudan kurtarın, şeffaflandırın ve kapatın.
Sonuçlar:
Endokrin ve DNES hücre granülleri................ koyu mavi-siyah
Kas ve sinirler gibi diğer yapılar ..................... siyah
Açıklamalar:
1-Doku gluteraldehit ya da Helly ile tespit edilmişse boyama süresi uzatılmalıdır.
2-Stabilize kurşun çözeltisi birkaç hafta dayanıklıdır, fakat çözelti taze olarak kullanılırsa daha iyi sonuçlar elde edilmektedir.
3-Kesitler suya indirildikten sonra 0.2 M1 lık HCL çözeltisinden geçirerek hidrolize edilirse daha iyi boyama sonuçları alınmaktadır.
60-65 C’ de 3-4 saat: formalin, paraformaldehit ve Bouin ile tespit edilenler
60-65 C1 de 12 saat: gluteraldehit veya Helly ile tespit edilenler
Histoloji
-
Endosülfan ve okratoksin-A’nın birlikte sıçanlarda toksisitesi: histopatolojik değişiklikleri
-
Histoloji Pdf Ders Notları
-
DEKALSİFİYE EDİLMEMİŞ KESİTLERİN HAZIRLANIŞI
-
DEKALSİFİKASYONU TEST ETMEK
-
KELATLAMA AJANLARI
-
ELEKTROLİTİK DEKALSİFİKASYON
-
ASİT DEKALSİFİKASYON SIVILARI
-
Histopatoloji nedir ?
-
KEMİK DOKUSU VE DEKALSİFİKASYON
-
MSS’DE DEJENERE MİYELİNİN GÖSTERİMİ
-
MARKSCHE’DEN BOYASI (Spielmayer, Benda)
-
MSS‘DE MİYELİNİN GÖSTERİMİ
-
KARIŞIK OLAN TEKNİK
-
BİELSCHOWSKY TEKNİĞİ
-
GÜMÜŞ ÇÖKTÜRME YÖNTEMLERİ