FİKSATİFLER VE HAZIRLANIŞLARI
Fiksatifler kullanımlarına göre iki gruba ayrılabilir.
l-Mikro-anotomik fiksatifler: Bu fiksatifler doku tabakaları arasındaki bağlantıları ve geniş hücre kümelerinin diğeri ile bağlantılarını tam olarak korumak amaçlandığında kullanılır. Normal ve patolojik histolojinin rutin çalışmalarının çoğu bu tip fiksatiflerle yapılmaktadır.
2-Sitolojik fiksatifler: Hücreyi oluşturan elementleri korumak istendiğinde kullanılırlar. Penetre olma gücü, büyük doku kütleleri ile çalışma yeteneği, kesit almayı veya boyamayı engellememeli. Şöyleki Flemming fiksatifinde ara zon çok güzel fikse olurken en dış ve iç parçalar kötü fikse olabilirler.
% 10’luk Formalin
Formalin 100 cc
Çeşme Suyu 900 cc
%10'luk Formal Salin
Formalin 100 cc
NaCl 8.5 gr
Çeşme suyu 900 cc
%10' luk Tamponlanmış Formalin (pH=7.0)
Formalin 100 cc
Çeşme suyu 900 cc
NaH2P04 : H20 4 gr .
Na2HP04 6.5 gr
Formalini nötralize etmek için %2' lik kalsiyum asetat birçok araştırıcı tarafından tavsiye edilmiştir. Fakat yumuşak dokularda artifakta benzer alanlar oluşturabilir.
%10' luk formal-salin histolojik fiksatiflerin ençok kullanılanıdır. Aşırı bir sertleşme olmaksızın dokuyu sertleştirir. Fiksasyon süresine dayanıklıdır. Genellikle formalin fiksasyonundan sonra dokuların doğal rengini kısmen veya tamamen korumak mümkündür. Bu fiksatif, müze örneklerinin hazırlanmasında özel bir değere sahiptir. Özellikle nötral tamponlanmış olarak kullanıldığında kırmızı kan hücrelerinin korunması içeren iyi fiksatiftir.
Formalinde uzun süre kalma (aylarca-yıllarca) dokunun kesit alma niteliğini bozmaz. Dokunun bazik boyalarla boyanmasında biraz kayba yol açabilir. Bazı gümüş çöktürme tekniklerindeki sonuçlar daha iyiye gidebilir. İnce bloklar % 10'luk formal-salinle 24-48 saatte iyi şekilde fikse olurlar fakat optimum fiksasyon süresi 7-10 gündür. Formalin fiksasyonundan sonra, değişen miktarlarda kan içeren dokular bir artifakt pigmenti (formalin pigmenti) gösterebilirler. Bu, kahverengi, granüler, ekstraselüler bir materyeldir. Çoğunlukla post-mortem dokularda bulunur, saklandıkca artar ve sıklıkla formaline daldırdıktan birkaç saat sonra yoktur fakat birkaç gün sonra dokularda çok geniş ve fazla olarak depo edilir. Kanla asit formalin pigmente yol açar ve nötral tamponlu solusyonlar kullanarak bunlardan kurtulabilir. Pikrik asidin alkolde doymuş solusyonunda 20 dakika ya da daha fazla tutarak kesitlerden uzaklaştırılabilir. Pigmentin görünümü ve özellikleri malarya pigmentine benzemektedir fakat malarya pigmenti intraselülerdir.
% 10' luk formal-saline mikroanotomik bir fiksatiftir. Birçok boyama yöntemi için uygundur. Hematoksilenle iyi sonuçlar verir. Nadiren belirli hiçbir neden olmaksızın formal-salinle tespit edilip, H+E ile boyanmış kesitlerde garip bir artifakt görüIür. Nukleusların hematoksilen ile kısmen veya tamamen boyanmamasına, bunun yerine eozini almasına sonuçta ise çekirdek kenarlarının kaybına yol açar. Ençok lenfoid ve epitel dokusunda göze çarpan artifakt, dağılımında aşırı olarak bozuktur ve garip bir şekilde fiksasyonu iyi yapılmış dokularda ortaya çıkar. Nadiren otolize olmasına rağmen, postmortem dokularda da görülür. Bu artifakt "pembe hastalık" olarak açıklanmıştır ve ortaya çıkmaması için %1O'luk formalindeki %2' lik asetik asit kullanımı ile korunur veya olduğunda parafini alınmış kesitlerin hematoksilenle boyanmasından önce absolu alkoldeki %l'lik HCl ile 1 saat bırakarak uzaklaştırılır. Formalin fiksasyonundan sonra hiçbir şeye gereksinim yoktur ve dokular gömmeden önce direkt % 70'lik alkole alınabilir veya dondurma yöntemi ile kesit alınabilir .
ALKOL-FORMALİN SOLUSYONU:
Nötralize edilmiş formalin 10 cc
%95 Alkol 90 cc ,
Bu fiksatifte parçalar 2-4 saat içinde çabucak tespit olur. Eğer doku parçaları kalın olursa, bu solusyon içinde buzdolabında 24 saat kalmalıdır. Bilhassa polisakkaridlerin gösterilmesi için kullanılan fiksatiflerden biridir.
ALKOL FİKSATİFLERİ: Absolu alkol (%99) özellikle hücrelerde glikojenin gösterilmesinde kullanılan bir fiksatiftir. Eğer buzdolabında veya daha düşük derecede kullanılmazsa dokuda büzülmelere sebep olur. Doku parçaları absolü alkolde 20C'de iki gün bırakılacak olursa en elverişli şekilde, büzülrne meydana gelmeden tespit olurlar. %80 alkol fiksatif ise 5C'de 24-48 saat arasında dokuyu büzmeden tesbit etme özelliğine sahiptir. Bu solusyon alkaline phosphatasın gösterilmesinde kullanılır. Alkol fiksatifleri oda ısısında kullanıldiklarında bunların %65-%70' lik solusyonları kullanılmalıdır. Aksi halde dokuda çok fazla büzülme ve değişikliklere sebep olurlar.
LİSON VOKAER' İN GLİKOJEN TESPİT ÇÖZELTİSİ: %96' lık alkolde doymuş picric
asit çözeltisinden 85 ml; 10 ml formalin, 5 ml asetik asit. Küçük parçaları buzdolabında 5-10 saatte tespit eder. Glikojen için iyi tespit edicidir. Tespitten sonra absolu alkolden geçirilerek gömme işlemi yapılmalıdır. Çünkü gıikojen suda erir.
MERKÜRİK KLORİD-FORMALİN (FORMAL-SUBLİMATE)
Suda doymuş merkürik klorid 900cc
Formalin 100 cc
Mükemmel bir mikro-anotomik fiksatiftir. Formal-salindeki distorsion olmadan dokuyu büzer. Asit boyalarla çok parlak boyadığı gibi mükemmel bir sitoplazma korunması sağlar ve metakromaziyi artırır.Formal-saline göre sinir fibrilleri ve hücreler için gümüş çöktürme tekniklerinde daha az elverişli olmasına rağmen mükemmel retiküler fibril impregnasyonu elde edilebilir. Bloklar 12-24 saat tespit edilir fakat uzun süre işlem kesit almayı zorlaştıran bir sertlik yaratmaz. Formal-sublimat özellikle formal-salinle birinci fiksasyondan sonra ikinci fiksatif olarak yararlıdır. En büyük dezavantajı pahalı olması ve metallere korosiv olmasıdır. Dokular fiksasyondan sonra %70-90' lık alkole aktarılmalı ve mercury pigmenti kesitlerden daha önce açıklandığı gibi uzaklaştırılmalıdır.
SUSA FİKSATİFİ ( HEİDENHAIN 1916)
Merkürid klorid 45 gr
Sodyum klorid 5 gr
Trikloroasetik asit 20 gr
Asetik asit 40 cc
Formalin 200 cc
Distile su 800 cc
Özellikle biopsi materyelleri için uygun bir fiksatiftir. İyi bir mikro-anotomik fiksatiftir. Nedeni açık olmamakla birlikte Susa' dan sonra elastik fibriller Weigert'in (1898) elastik fibril boyası ile zayıf boyanırlar. Hazırlanması için gerekli maddelerin çokluğu dezavantajdır. Ancak karışım bir önceki formal-sublimata göre biraz daha avantajlıdır.
Bloklar 3-24 saatte fikse olurlar ve direkt olarak % 95' lik etil alkole aktarılırlar. Daha sulu solusyonlara aktarma kollajen fibril1erin şişmesine yol açmaktadır.
ZENKER FİKSATİFİ ( ZENKER 1894)
Merkürik klorid 5 gr
Potasyum dikromat 2.5 gr
Sodyum sülfat 1 gr .
Distile su 100 cc
Asetik asit 5 cc (kullanımdan hemen önce eklenir)
Asetik asitsiz stok solusyon iyi korunur. Zenker etkili bir mikro-anotomik fiksatiftir ve özellikle sitoplazmik ve fibril boyaları üzerine çok yararlı etkisinden dolayı kullanılmaktadır. Taze materyelde post-mortem dokulara göre daha yararlıdır. Alyuvarları iyi korumazlar. Bloklar 3-8 saatte fikse olurlar ve fazla dikromatı uzaklaştırmak için çeşme suyuyla yıkanırlar. Mercury pigmenti ise daha önceki yöntemle uzaklaştırılır.
HELLY SIVISI ( VEYA ZENKER-FORMAL, HELLY 1903)
Zenkerdeki asetik asit yerine 5 cc formalin kullanmadan hemen önce eklenir. Helly sıvısı bir oksitleyici ajan (potasyum dikromat ve bir indirgeyici ajan (formalin) içermesine rağmen rnükemmel bir fiksatiftir. Helly özellikle kemik iliği, dalak, lenf bezleri, hipofiz ve pankreas için çok yararlıdır. Bloklar 6-24 saat tespit edilmeli ve mercury pigmenti Zenkerdeki gibi uzaklaştırılmalıdır. Helly hem mikro-anotomik hem de sitolojik (sitoplazmik) fiksatif olarak kullanılabilir ve formal-sublimat gibi % 10' luk formal-salinden sonra ikinci fiksatif olarak da uygulanabilir.
BOUİN FİKSATİFİ ( BOUİN l897)
Suda doyurulmuş pikrik asit 75 cc
Formalin 25 cc
Asetik asit 5 cc
Bouin, alyuvarların kısmen veya tamamen lizisine yol açar ve kollajen fibrilleri şişebilir. Aşırı sertleşmeye yol açmaz. Sitoplazmik boyalarla parlak boyanma sağlar. Glikojen çok iyi korunur (özellikle yukardaki karışımın alkolik varyantı ile) fakat böbrek iyi korunamaz. Bazı sitoplazmik granüller çözünebilir. Bouin, bir mikro-anotomik fiksatif veya kromozomların gösterilmesi için kul1anıldığında da sitolojik (nükleer) fiksatiftir. Bloklar 6-24 saat fikse edilirler ve % 70 lik alkole aktarılırlar. Dokuların sarı boyanması çok küçük örnekler için avantaj oluşturur. Fakat kesitlerden bu boya, alkolü takiben bazik anilin boyaları kullanmadan önce % 2.5 lik sodyum thiosulfat kullanarak uzaklaştırılmalıdır, aksi takdirde precipat oluşacaktır.
CARNOY FİKSATİFİ (CARNOY, 1887)
Absolü alkol 60 cc
Kloroform 30 cc
Asetik asit 10 cc
Carnoy, hızla penetre olan ve hareket eden bir fiksatiftir. Acil teşhis için dokuların hızlı tespit edilmesi ve kısmi dehidrasyonu için kullanılır. Kromozom çalışmaları için kullanılır fakat alyuvarların lizisine ve fazla büzülmeye yol açar. Glikojen korunur fakat bazı sitoplazmik granüller çözünebilir. 3 mm' den kalın olmayan dokular 30-90 dakikada fikse edilmeli ve % 95'lik ya da % 100' lük alkole transfer edilmelidir. Bir mikro-anotomik veya sitolojik (nükleer) fiksatifdir.
SANFELİCE FİKSATİFİ (SANFELİCE, 1918)
Çözelti A Çözelti B
Formalin 128 cc %l'1ik kromik asit 100 cc
Asetik asit 16 cc
Karışım: Kullanmadan az önce hazırlanır. 9 cc A +16 cc B
Genellikle mitotik figürler ve kromozomlar için mükemmel bir fiksatifdir. 3 mm den kalın olmayan küçük parçalar 12-24 saatte tespit edilmeli ve sonra akarsu ile yıkanmalıdır. Sitolojik (nükleer) fiksatiftir.
FLEMİNG FİKSATİFİ (FLEMMİNG, 1884)
% l'1ik kromik asit 15 cc
%2' lik OSO4 4 cc
Asetik asit 1 cc ya da daha az
Kullanmadan önce hazırlanmalıdır. Penetrasyon eşit olmayabilir ve tam olmayan fiksasyonla yüzeyel tabakaların aşırı kararmasına neden olabilir ve sonradan en içteki hücrelerin zayıf boyanmasına yol açabilir. Page (1970), Flemming sıvısını formalin fiksasyonunu takip eden ikinci fiksatif olarak kullanarak miyelini .başarılı şekilde göstermiştir. İki mm kalınlığındaki küçük parçalar 12-48 saat tespit edilmeli ve sonradan akarsuda yıkanmalıdır. Asetik asit içeriği ile bir nükleer fiksatiftir. Lipidler OSO4 ile siyahlaşır. Bu fiksatiften sonra alum hematoksilen nükleer boyaları kolaylıkla alınmaz, bunun yerine safranin kullanılmalıdır.
FLEMİNG SIVISlNIN LEWITSKY-BAKER MODIFIKASYONU
Flemming sıvısını asetik asitsiz fakat % O.75'lik sulu NaCl solusyonunu distile su yerine çözücü olarak ekleyerek hazırlanır. 12-24 saatlik fiksasyondan sonra dokular akarsuya aktarılır. Sitolojik (sitoplazmik) fiksatif, bu ve diğer krom-osmium karışımlar omurgasız ve alt omurgalıların dokuları ile çok iyi sonuçlar verirler. Helly sıvısı memeli dokuları için tavsiye edilmemektedir.
ORTH FİKSATİFİ ( ORTH 1896)
Formalin 10 cc
Müller sıvısı (Potasyum dikromat 2.5 gr +sodyum sülfat 1 gr+distile su 100cc) 100 cc
Taze olarak hazırlanmalıdır. Formalin ve Müller sıvısını karıştırma mitokondri gibi sitolojik yapılar üzerine ve kromaffin reaksiyonundaki mordantlama özelliği nedeni ile çok yararlıdır. Bloklar çeşme suyuyla yıkanmadan veya distile sudaki %2.5'lik potasyum dikromatla ileri kromasyondan önce 24-48 saat tespit edilmelidir.Bazen potasyum dikromatla uzun süre muamele etme hemen hemen kaçınılmaz olarak kırılganlıkta artış ve parafin kesitlerden kesit alma zorluğu ile (özellikle yumuşak dokularda, dalak ve beyin gibi) sonuçlanmaktadır.
Histoloji Laboratuvarı
-
Glasiyal asetik asit (CH3COOH) nerelerde kullanılır? nasıl hazırlanır ?
-
Formaldehit özellikleri nelerdir? nasıl hazırlanır
-
Histoloji Preperatların Etiketlenmesi
-
DONDURMA YÖNTEMİ
-
Histoloji Preparatı Kesit alma işlemi
-
HİSTOLOJİ PREPARATLARININ LAM ÜZERİNE YAPIŞTIRILMASI
-
PARAFİN KESİTLERİN HAZIRLANMASI
-
TEMELİNDE SUBLİME VE KARIŞIMLARI BULUNAN TESPİT SOLUSYONLARI
-
TEMELİNDE PİKRİK ASİT BULUNAN TESPİT SOLUSYONLARI
-
TEMELİNDE DİKROMAT BULUNAN TESPİT SOLUSYONLARI
-
ETİL ALKOL BULUNAN TESPİT SOLUSYONLARI
-
FORMALDEHİTLİ TESPİT SOLÜSYONLARI
-
İyi bir fiksatifte aranan nitelikler
-
Fiksatif seçimi ve süresi
-
E- MASERASYON YÖNTEMİ