Floresans boyalar ve Floresans Boyama
Floresan mikroskopide, preparatlara kısa dalgalı ışıkla ışın uygulamsı yapılır ve belli yapılar veya boyalar nedeniyle yayılan uzun dalgalı ışık (floresan) gözlemlenir. Bu amaçla uzun dalgalı ultraviyole ( UV ) ışık ya da mavi viyole ışık kullanılır. Başlangıçta, numunelerin yayaldığı doğal floresans analiz edilmiş; daha sonra, floresans olmayan preparatlar az miktarda floresans boya ile işaretlenip mikroskop altında analiz edilir.
FLORESANS BOYAMA
Fluorochromlar, asidik veya bazik boyalar olarak hareket eden kromoforlu ve auxokromlu quinonoid boyalardır. Bu boyalar dokularla birleştiklerinde ultraviyole ışığı, görünen ışığa çevirme kapasitesine sahiptirler. Ultraviyole ışığın kullanımı ile fluorokromla birleşmiş dokuları tanıyabilirken; dokuları gün ışığında oluşan renkle tanıyamayız. Flurokromlar, floresans olmayan boyalardan daha spesifik değildirler ancak çok hassastırlar. Floresans, bazı
maddelerin belirli bir dalga boyunda aydınlatıldığında farklı ve daha uzun ışınları yayma özelliğidir. Floresans teknikler çok kullanılır. Flurokrom boya yöntemleri ise doku bileşenlerinin, bakterilerin, fungusların , ağır metallerin gösteriminde, eksfolyatif sitolojide malign hücrelerin tanınmasında rutin olarak kullanılmaktadır. Floresans mikroskopi, dokulardaki ve serumlardaki antijen ve antikorların gösteriminde kullanılan immüno floresan tekniklerin temelini oluşturmaktadır.
İki tip floresan vardır:
1-Primer Floresans (doğal-otofloresans): Vitamin A, riboflavin, porfirin, kloroplast gibi biyolojik materyelin kendi özelliğidir. Dokular, genel mavi floresansa sahip olabilirler ve bu elastik fibrillerde kuvvetlidir. Civa, demir ve iodine gibi bazı maddeler doğal floresansı ortadan kaldırır.
2-Sekonder Floresans (yapay-indüklenmiş): Doğal floresans olmayan maddelerin acridin orange, auramine, thioflavine-T vb bir flurokrom boya ile etkileşimden sonra ortaya çıkar. Yapay floresanla malign hücreler, acridine orange ile birleştiğinde çok hızlı gösterilebilir. Floresan mikroskopi tekniklerinde indüklenerek oluşturulan yapay floresansın birçok avantajı vardır. Çok az bir floresans materyel görülebilir floresans üretir. Çok düşük konsantrasyondaki doku bileşenlerinin çok az floresan boya ile gösterilebilir. Floresan boyalar toksik etki yaratmaksızın canlı hücrelere de verilebilir. Yöntem çok hassastır ve iyi kontrast verir. Yapay floresans da ağır
metallerle haraplanır. Bazı tekniklerle başarılı sonuçlar için tamponlanmış flurokrom boya solusyonları gereklidir.
BAZI FLORESANS BOYALAR
Akridin orange Certistain
Kalzein
Rhodamine B
Pararosanilin Certistain
Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC)
Auramine O
Asit fuksin Certistain
Pyronine G Certistain
4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride ( DAPI )
Pararosaniline (chloride)
Pyronine G
Acridine orange zinc chloride double salt
Hoechst boyası
Hoechst boyaları floresans mikroskopisinde ve akış sitometresinde DNA'yı işaretlemek için kullanılan floresan boyalardandır. Bu boyalar DNA'yı işaretlediği için, ayrıca mitokondrileri boyamakta da kullanılır. bis-benzimid türü olan bu boyalardan iki tanesi yaygın olarak kullanılır: Hoechst 33258 ve Hoechst 33342.
Her iki boya da morötesi ışık ile 350 nm civarında uyarılır, her ikisi de 461 nm yayım maksimumunda mavi/siyan renkte floresan ışık yayarlar. Hoechst boyaları canlı veya fikse edilmiş hücrelerde kullanılabilirler, çoğu zaman bir diğer nükleik asit boyası olan DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) yerine kullanılırlar. Aralarındaki en önemli fark, Hoechst 33342'deki ek etil grubunun onu daha lipofilik yapması ve dolayısıyla hücre zarı ile etkileşmesini daha muhtemel kılmasıdır. Bazı uygulamalarda Hoechst 33258 belirgin derecede daha az zar geçicidir.
Bu boyalar ile, standart bir floresan yayım - miktar eğrisine bakılarak, bir numunedeki DNA miktarı tespit edilebilir.
Hoechst boyaları DNA'ya bağlandığı için hücre bölünmesi sırasında DNA ikileşmesini bozabililer. Dolayısıyla potansiyel olarak mutajenik ve kanserojeniktirler. Kullanım ve atımlarında gerekli tedbirler alınmalıdır.
Hoechst boyaları insan ve diğer hayvanlarda sperm ayrımı için de kullanılırlar.
AURAMİNE – RHODAMİNE FLORESAN BOYAMA
Direkt mikroskopi teknikleri konusunun giriflinde verilen genel bilgiler ve yayma preparatın hazırlanması aflamaları hem karbol fuksin boyama hem florokrom boyama yöntemlerinde aynıdır. Rutinde tanı amaçlı en sık karbol fuksinli (Erlich Ziehl Neelsen- EZN , Kinyon) boyama kullanılmakla birlikte, daha duyarlı ve hazırlanan preparatın daha hızlı taranmasını sağlayan florokrom boyalar da kullanılabilir. Bu boyama yöntemlerinde, daha küçük bir büyütme ile daha geniş bir alan taranabilir ve preparatın taranması için gereken zaman azalır.
Bu nedenle özellikle zaman problemi olan ve fazla sayıda hasta örneğinin işlemlendiği laboratuvarlarda, florokrom boyama yöntemleri hem tanı için hemde antitüberküloz tedavi alan hastaların izleminde tercih edilebilir.
Florokrom boyamada ana ilke fenollü fuksin yerine floresan boyaların kullanılmasıdır. Floresan boyalar, mikobakterilerin lipitten zengin hücre duvarına bağlanarak, görünür hale gelmesini sağlar. Ancak boyaların hazırlanması, amaçlanan hedef (doku, mikroorganizma, antijen antikor kompleksi vs.) ve
boyama ifllemi sırasında ısı-süre değiflikliklerinin uygulanması gibi, bazı kriterlere göre, farklı floresan boyama yöntemleri uygulanabilir. Bu yöntemler arasında Auramin-Fenol boyama yöntemi, Glikerson ve Kanner’in floresanlı boyama yöntemi, Auramine-Rhodamine boyama yöntemi, Truant’ın modifiye Auramine-
Rhodamine boyama yöntemi sayılabilir. Kullanılan auramin’in karsinojen olduğu unutulmamalı, özellikle direkt temas-hava yolu izolasyon önlemleri alınmalıdır.
AURAMİN-RHODAMİNE BOYAMA İŞLEM BASAMAKLARI
A. Örneklerin Hazırlanması : Karbol Fuksin boyama yönteminde anlatıldı.
B- Kimyasal Maddelerin Hazırlanması
1.Auramine - Rhodamine Floresan Bayanın Hazırlanılması
2.Asit Alkol Hazırlanması
Etil alkol (% 70’lik)
99.5 ml
Konsantre HCl
0.5 ml
3.Karflıt Boya Çözeltisi Hazırlanması
Potasyum permanganat (KMnO4)
0.5 gr
Distile su
100 ml
C- Kalite Kontrol
Her boyama için mutlak pozitif ve negatif kontroller hazırlanmalıdır.
Pozitif kontrol hazırlanması: Middleebrook 7H9 sıvı besiyeri içinde mikobakteri (mümkünse standart M tuberculosis H37Rv) süspansiyonu hazırlanır.Bu süspansiyondan lam üzerine bir damla konularak ya ısıtıcı blokta ya da havada kurutulup, tespit edilir.
Negatif kontrol hazırlanması: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ile sıvı besiyerinde hazırlanan süspansiyondan bir damla lam üzerine konularak ya ısıtıcı blokta ya da havada kurutulup, tespit edilir.
D- İşllemin Uygulanması
• Oda ısısında saklanan boyalar kullanılmadan öncemutlaka iyice çalkalanmalıdır.
• Hazırlanan lamlar alevde fiske edilir. (Resim 1)
• Hazırlanan lamların üzerine AR boyası dökülür ve 15-20 dakika oda ısısında beklenir. Boya lamın üzerini tamamen kaplamalı ve eksilmemelidir (Resim 2,3).
• Distile su ile yıkanır. Klorsuz su kullanılmalıdır, çünkü klor floresanı azaltır (Resim 4).
• Yıkama sonrası % 0,5 asit alkol dökülerek 2–3 dakika beklenir. Yeterli dekolarizasyon iflleminde çıplak gözle boya görülmez(Resim 5–7).
• Yıkama ifllemi tekrarlanır (Resim 8).
• Zemin boyası olarak hazırlanmıfl KMnO4 ile 2 dakika boyanır. Süre uzatılırsa floresan azalabilir (Resim 9).
• Yıkanır ve havada kurutulur (Resim 10).
• Pozitif bir yaymada mikobakteriler, karanlık bir zeminde sarı-turuncu parlak, ince, kıvrık içi tanecikli floresan veren bakteriler olarak görülür (Resim 11)
• Her örne¤in boyanması sırasında, mutlaka pozitif ve negatif kontrol kullanılmalıdır.
• Boyanan preparatlar en kısa sürede 25x ya da 40x büyütme ile floresan mikroskobunda incelenmelidir. Basil morfolojisi x1,000 ya da x450 büyütme ile kontrol edilmelidir.
• Gerekirse pozitif de¤erlendirilen preparatlar, EZN ya da Kinyon boya ile boyanabilir.
E. SONUÇLARIN BİLDİRİMİ:
Negatif: Floresan görülmeyen tüm yaymalar “ Aside dirençli basil görülmedi ‘’ fleklinde raporlanır.
Pozitif: Karanlık bir zeminde sarı-turuncu parlak, ince, kıvrık içi tanecikli floresan veren bakteriler olarak görülür “Aside dirençli basil görüldü’’ fleklinde rapor edilir. Boyanma yöntemi belirtilir ve yaymada gözlenen aside dirençli basilin miktarı hakkında bilgi verilir. Basilin miktarı hakkındaki değerlendirmede karbol fuksin boyama yönteminde kullanılan tablo rehber olarak kullanır.
KAYNAKLAR
1. Weitzman I. Mycobacteriology and Antimycobacterial Susceptibility Testing.
Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook ASM Press, Washington
DC, 2004; 7.2.1- 7.3.1.
2. Bilgehan H. Klinik Mikrobiyolojik Tan›. ‹kinci bas›m Bar›fl yay›nlar›. ‹zmir 1995
: 83-84.
3. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC. Color
Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Fifth edition Lippincott,
Philadelphia.1997: 903 – 905.
4. Uzun M. Tüberküloz tan›s›nda Ehrl›ch-Ziehl-Neelsen, Fluorokrom boyama
yöntemleri ile BACTEC ve Löwenstein-jensen Kültür yöntemlerinin sonuçlar›n›n
de¤er lendir ilmesi Doktora tezi . ‹stanbul T›p Fakültesi . 1994.
5. Baron JB, Peterson LR,Finegold SM. Bailey Scott’s Diagnostic Microbiology
9th edition. Mosby-Year Book, St Louis, Missouri. 1995:605-608.
6. Nolte FS, Metchock B. Mycobacterium. In: Murray PR, Baron EJ,Pfaller MA,
Tenover FC, Yolken RH eds. Manuel of Clinical Microbiology 6th ed. Washington.
ASM Press. 1995: 400-38.
7. http: / /www2.provlab.ab. ca/bugs/mycob/afb_stain/ znstain.htm
BİYOLOJİ ÖDEV YARDIM
-
Mercanlar ve Mercan resifleri hakkında bilgi
-
Kulak Nedir? Kulağın Yapısı ve Görevleri Nelerdir?
-
Göz nedir ? Gözün görevleri nelerdir ? Canlılarda göz ve görme organı
-
Boğaz nedir ? Boğazın kısımları nelerdir ?
-
Omurga, columna vertebralis nedir ? Görevleri nelerdir ?
-
Doğal gübreler nelerdir
-
Kimyasal (yapay) gübreler nelerdir
-
Kortizol Nedir
-
Semantik Nedir ?
-
Karasal Ve Sucul Biyomların Özellikleri Nelerdir ?
-
Kaç çeşit biyom vardır
-
Bitki Ve Hayvanların Yeryüzündeki Dağılımını Etkileyen Faktörler Nelerdir?
-
Bitkisel dokular hakkında bilgi
-
Ekosistemde besin zinciri ve besin ağının önemi nedir ?
-
Genetik Algoritmalar