Gram Boyama Testi Mikrobiyoloji

Christian Gram tarafından 1884 yılında geliştirilmiş diferansiyel bir boyama tekniği olan Gram boyama ile bakterilerin Gram reaksiyonu incelenir.

Tanımlamada önemli bir aşama olan Gram reaksiyonuna göre bakteriler Gram pozitif ve Gram negatif olmak üzere ikiye ayrılırlar. Ancak Mycobacterium gibi bazı bakterileri bu şekilde gruplandırma imkânı yoktur.
Preparat hazırlığı başlıca dört aşamadan oluşmaktadır; öncelikle incelenecek olan kültürden bir öze dolusu lam üzerine aktarılır ve lamın üzerine ince bir film tabakası halinde yayılır. Havada iyice kurumasının ardından bakterilerin lam üzerine tespiti yani fiksasyon işlemi yapılır. Son aşama olan fiksasyon için genellikle lamın alt yüzü üç kez Bunzen beki alevinden geçirilir. Preparat 18 – 24 saatlik kültürden hazırlanmalıdır. Daha yaşlı kültür kullanıldığı takdirde yanlış sonuç alınabilir. Gram varyabl olan yani Gram reaksiyonu değişken olan bazı Gram pozitif bakteriler Gram negatifmiş gibi değerlendirilebilir. Ayrıca Bacillus subtilis, B. anthracis gibi bazı bakteriler de 2 - 3 saatlik kültürlerinde Gram negatif özellik gösterdikleri halde zamanla Gram pozitif özelliğe sahip olmaktadır.
Gram boyama yapmak için hazırlanmış preparatın üzerine kristal viyole boyası damlatılıp 1 dakika beklenir ve iyot-lugol çözeltisi ile yıkanarak kristal viyole uzaklaştırılır. Preparata tekrar iyot-lugol çözeltisi damlatılarak 1 - 2 dakika bekletilip, distile su ile yıkanarak iyot-lugol çözeltisi uzaklaştırılır. Preparatın üzerine %96 'lık etil alkol veya eter – aseton çözeltisi damlatılarak 10 - 15 saniye beklenir, distile su ile yıkanır ve karşıt boya olarak safranin damlatılır ve 20 - 30 saniye bekletilir. Preparat distile su ile yıkanarak havada kendi halinde kurumaya bırakılır, preparata immersiyon yağı damlatılır ve 100 'lük objektifle incelenir. Mor renkli bakteriler Gram pozitif, pembe-kırmızı renkli bakteriler ise Gram negatif olarak değerlendirilir. Gram boyama için gerekli olan tüm çözeltiler hazır ticari kitler halinde de pazarlanmaktadır.
-Kristal viyole boyası: Kristal violet (gentian violet) 0,5 g; Distile su 100 ml bileşimindedir. Boya distile su içinde çözüldükten sonra kaba filtre kâğıdından süzülür.
-İyot-Lugol çözeltisi: Potasyum iyodür 2 g; İyot kristali 1 g; Distile su 300 ml bileşimindedir. Potasyum iyodür distile su içerisinde iyice çözüldükten sonra iyice ezilmiş iyot kristali ilave edilir. Tam bir çözünme sağlanana kadar karıştırılır.
-Safranin: Safranin 0,5 g; Etil alkol (%95) 10 ml; Distile su 100 ml bileşimindedir. Safranin etil alkol içinde çözündürüldükten sonra distile su ile karıştırılır.

#boyama #testi #mikrobiyoloji