İmmünopresipitasyon (IP) Tekniği

Protein Biyolojisi Kaynak Kütüphanesi

İmmunopresipitasyon (İmmun-çöktürme) yöntemi antijen saflaştırılmasında ve belirlenmesi için yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. Bu yöntemde kompleks antijen içeren solüsyondan ilgili antijenleri izole etmek için antijene spesifik antikorlar kullanılır ve ardından yapılan SDS-PAGE uygulamasıyla bir kompleks protein karışımında bulunan antikor-reaktif antijenin boyutunun belirlenmesi sağlanır.

IP yöntemi araştırmacıların protein karışımında bulunan belirli proteinin miktarını ve moleküler ağırlığını ölçmesine, protein aktivasyon durumunu ve post-tranlasyonel protein modifikasyonları belirlemesine, proteine bağlanan molekülleri elde etmesine olanak sağlar.

Genel olarak, IP yönteminin iki çeşit uygulaması vardır:

1. Pre-İmmobilize Yöntemi (Önceden Hareketsizleştirme Yöntemi): Bu yöntemde monoklonal ya da poliklonal olan antijene spesifik antikor agaroz ya da manyetik boncuklar gibi katı bir destek üzerinde önceden hareketsizleştirilir. Ardından ilgili katı destek hedeflenen protein içeren hücre lisatıyla inkübe edilir. Hareketsiz hale getirilen immün kompleks lisattan toplanır, yıkanır ve destekten ayrıştırılır. Ardından hedef antijenin yapısına bağlı olarak analizi yapılır.

Manyetik parçacıklar katı ve küreseldir. Her bir manyetik boncuğun yüzeyine sınırlı sayıda antikor bağlanabilir. Bu parçacıklar agaroz desteğiyle karşılaştırıldığında daha küçüktür. Agaroz desteği yüksek kapasiteli antikor bağlanması için yeterli yüzey alanına sahiptir.

2. Serbest Antikor Yöntemi: Bu yöntemde serbest, bağlanmamış birincil antikorun lizatta sunulan ilgili protein ile immün kompleksi oluşturması sağlanır, ardından çözünmeyen bir afinite desteği (protein A, G ya da proteinA/G) kullanılarak aşağıya çekilir. Bu yöntem daha çok karışım içinde hedeflenen proteinin az konsantrasyonda olduğu durumlarda uygulanır. Antijen-antikor bağlanma kinetiği zayıftır.

Geleneksel olarak tekli proteinler, özel proteinlerin tanımlanması, yapısının, ekpresyonunun, aktivasyonunun ve meydana gelen modifikasyonların belirlenmesi için immüno- presipitasyonla hücre lisatından izole edilir. IP yöntemi aynı zamanda hedef proteinin nükleik asitlerle ya da diğer proteinlerle etkileşiminin incelenmesi için kullanılabilir. (Protein-Protein Etkileşimi // Protein-Nükleik Asit Etkileşimi)

Immünopresipitasyon yönteminin değişik uygulama biçimleri vardır:

* Kromatin IP (ChIP)

* Anti-FLAG antikorlarla IP gibi.

Şekil 1:IP uygulama yöntemleri.

IP Yöntemi için Manyetik Boncuk Kullanımının Avantajları

* Kapasite ve Verim: Agaroz desteği sünger benzeri bir yapıda olduğu için gözeneklidir, geniş yüzey-alan-hacim oranlarına sahiptir. Bu nedenle agaroz destek antikor için yüksek oranda bağlanma kapasitesine sahiptir. Manyetik boncuklar ise pürüzsüz bir yüzeye sahip olduklarından antikorların bağlanma oranları agaroz desteğe kıyasla daha sınırlıdır.

Ayrıca agaroz üzerinde bulunan bağlanma bölgelerine antikor her zaman bağlı kalmaz. Boşluklu yapıda olduğu için yıkama sırasında antikor kaybı gözlenebilirken manyetik boncuklarda bu durum gözlenmez. Antikorlar kolayca bağlanır ve yıkama aşamasında kayıpları gözlenmez. Bu nedenle manyetik boncuklar, agaroz destekle karşılaştırıldığında bağlanma kapasiteleri az olmalarına rağmen daha yüksek verimlilikte antikor tutarlar.

* Tekrarlanabilirlik ve Saflık: Agaroz destekten immün komplekslerin yapıya zarar verilmeden toplanması zordur ancak manyetik boncukların toplanması mıknatısla kolayca tüpün bir kısmına toplanabilir. Agaroz uygulamasında daha uzun inkübasyın gereklidir. Antikorla olan etkileşimleri manyetik boncukların dış yüzeyinde meydana geldiğinden ve boncukların büyüklükleri genel olarak eşit olduğundan, manyetik boncuklar genellikle agaroz ile karşılaştırıldığında daha yüksek tekrarlanabilirlik ve saflık sağlarlar.

* Süre, Kullanım Kolaylığı: Agaroz destekli IP uygulaması yaklaşık bir-bir buçuk saat sürerken manyetik boncuklu IP yaklaşık 30 dakika sürer. Ayrıca manyetik destekli IP ile birden fazla örneğin kolayca ve hızlıca ayrıştırılmasını da sağlar.

Çeviren ve Derleyen: Merve Gül Turan

Kaynak:https://www.thermofisher.com/tr/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunoprecipitation-ip.html (Erişim Tarihi:16.12.2018)

#immünopresipitasyon #tekniği