Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

İNTERMEDİET FİLAMANLARIN GÖSTERİMİ SİTOKERATİN VE VİMENTİN BOYAMA YÖNTEMİ (APAPP Yöntemi )

---

1-Önceden soğutulmuş 50:50 metanol / aseton fiksatifinde 1.5 dakika fikse edilir.
2-pH=7.6 olan Trisle tamponlanmış salinde 5 dakika yıkanır.
3- 1:400 oranında seyreltilmiş yaklaşık olarak 30 ml ICL fare antihuman monoklonali ilk antikor olarak uygulanır. Oda ısısında 2 saat bırakılır.
4- Trisle tamponlanmış salinde 5 dakika yıkanır.
5-1:20 oranında seyreltilmiş 30 ml tavşan anti fare (RAM) poliklonal 2 antikoru uygulanır. Oda ısısında 30 dakika inkübe edilir.
6- Trisle tamponlanmış salinde 5 dakika yıkanır.
7-3 ml APAPP 30 dakika uygulanır. 5-6 ve 7. işlem basamakları tekrarlanır.
8-Beş dakika yıkanır.
9-Filtre edilen substrat (hazırlanışı aşağıda verilmiştir ) uygulanır ve 15 dakika beklenir.
10-Çeşme suyunda yıkanarak hematoksilen ile zıt boyama uygulanır.
Substrat:
Naphtol AS phosphate........................2 mg
Dimetilformamide................................0.2 cc
M TRİS tamponu (pH=8.2)................9.8 cc
M Levamisole....................................10 ml
Fast Red-TR Base..............................10 mg

---