Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

Koloni PCR

---

Moleküler klonlama; hedef hücreye aktarılmak istenen DNA fragmentinin bir vektör aracılığı ile hedef hücreye aktarılması ile ekspresyonunun sağlanması işlemidir.

Moleküler klonlamanın temel aşamaları olarak; hedef genin genomdan elde edilerek vektörle ligasyonunun sağlanması, ligasyon gerçekleştirildikten sonra kompetan hale getirilmiş hücreler ile ligasyon içeriğinin karıştırılarak transformasyonun sağlanması -elektroporatik yolla ya da kimyasal yolla aktarım-, transformasyon yapılan hücre kültüründen rekombinant vektörü alan hücrelerin diğer hücrelerden ayrılması için seçici marker ile seçilimi sayılabilir.

 

Moleküler klonlama işleminde önemli aşamalardan biri kullanılan vektörün çeşidinin belirlenmesidir. Bu işlem için kullanılan vektörün hedef hücreye uygun olması, vektöre eklenecek DNA fragmentinin vektörün transformasyonuna engel olmayacak boyutta olması, vektörün hücredeki ekspresyon sistemlerini kullanabilir olması gibi önemli ve dikkat edilmesi gereken noktalar bulunur. Örneğin bakteri hücresine transforme edilen bir vektör bakteri hücresinin transkripsiyon faktörlerinin tanıyacağı diziler içermelidir.

 

Vektöre aktarılmak istenen DNA fragmenti gDNA’dan RE kullanılarak ya da PCR ile hedef bölgenin çoğaltımı sağlanarak elde edilebilir. Bu fragmentin 5’ ve 3’ uçlarının vektörün 3’ ve 5’ uçlarıyla uygun olması gerekir. Kohezif uçlu vektör ve DNA fragmenti kullanılıyorsa farklı RE kesimim ile insertün vektöre doğru yönde eklenmesi sağlanabilir ancak küt uçlu vektör ve/veya fragment kullanılıyorsa adaptör, linker ekleme gibi farklı yöntemler kullanılarak kohezif uç oluşumu sağlanabilir. Oluşturulan kohezif uçlar birbirine komplementer olduğundan iki molekülün ligasyonu DNA ligaz enzimi ile sağlanır. Bu iki yöntemin dışında iki küt uçlu molekülün ligasyonu da yapılabilir ancak bu yöntemde eklenen DNA fragmentinin eklenme yönü hakkında kesin yorum yapılamaz. Eklenen fragment vektör ucunda komplementer bir diziye sahip olmadığı için rastgele olarak vektörün ucuyla ligasyonu T4 DNA ligaz enzimi kullanılarak enzimatik olarak katalizlenir (1). Küt uç ligasyonu sonrasında elde edilen vektördeki insert yönünün belirlenmesi için transformasyon yapılarak rekombinant bakteri hücresi kullanılarak koloni PCR ve ardından dizileme yapılarak yön tayini yapılabilir. Bu yöntem dışında RE kesimi yapılarak da vektörün yönü hakkında bilgi edinilebilir ancak koloni PCR uygulaması daha ucuz ve daha pratik olduğu için daha elverişlidir (2).

 

Koloni PCR, moleküler klonlama deneyi sonrasında rekombinant hücrelere aktarılan vektördeki insertün doğru konformasyonda eklenip eklenmediğinin tespit edilmesinde kullanılan bir PCR uygulamasıdır (3). Bu yöntem ile eklenen DNA fragmentinin primerler ile hedeflenerek PCR boyunca amplifiye olması sağlanır. Bu amplifikasyon ile elde edilen ve hem primer diziyi hem de insertü içeren DNA fragmentleri oluşturulur. Primerlerin yönleri ve dizileri bilindiği için sonrasında bu ürünlerin dizilemesi ile insertün eklenme yönü belirlenebilir. Koloni PCR ile sentezlenen ürünlerin doğru boyutta amplifiye olup olmadığının bir ön kontrolü olarak jel elektroforez sistemine yükleme yapılabilir. Bu basamakla amplifiye edilen fragmentin yaklaşık uzunluğu belirlenerek primer bağlanmasında hata varsa tespiti, kontaminasyon olup olmadığının kontrolü, spesifik olmayan ürün oluşumunun varlığı, PCR’ın gerçekleşip gerçekleşmediği kontrol edilebilir. Koloni PCR uygulaması rekombinant bakterilerin büyütüldüğü agar besiyerindeki bir koloni ile yapılabilir. Petri üzerinde orta boyutta ve tekli olarak bulunan koloni bir pipet ucu ile alınarak PCR reaksiyonu içerisinde çözündürülür (Şekil 1). Bakteri hücrelerine direkt uygulanan ya da PCR içerisinde uygulanan yüksek sıcaklık ile hücre membran yapısında bulunan proteinlerin denatüre olması ve hücrede bağımsız olarak bulunan plasmidlerin kalıp olarak kullanılması için ortama salınması gerçekleştirilir. Hücre yapısının sıcaklıkla bozulmasından sonra reaksiyon ortamında hem bakterinin kromozomal

DNA’sı hem de plasmid DNA’sı bulunur. Bu aşamada PCR’ın hangi DNA’yı kalıp olarak kullanacağı primerlerin spesifikliğine bağlı olarak belirlenir. Moleküler klonlamada kullanılan vektörde bu primer dizileri ekli olarak tasarlanır. Vektörün çoklu klonlama bölgesinin (MCS’nin) upstreaminde ve downstreaminde olacak şekilde primerler eklenir. Bu sayede sadece eklenen insertün bulunduğu bölüm ve primer dizilerinin PCR ile çoğaltılması sağlanır. Amplifikasyon sonrasında dizi analizine gönderilen fragmentlerde kullanılan primerlerin sentez yönü ve dizisi bilindiği için insertün yönünün belirlenmesi sağlanır.

Düzenleyen ve Yazan: Merve Gül TURAN

Kaynakça:

1. Yazıcıoğlu BI (2019). Gen Manipülasyonunda Kullanılan Araçlar MBU II Föyü, Haliç Üniversitesi, İSTANBUL.

2. https://blog.addgene.org/plasmids-101-colony-pcr (Erişim Tarihi: 08.04.2019)

3. Yazıcıoğlu BI (2019). Koloni PCR MBU II Laboratuvar Föyü, Haliç Üniversitesi, İSTANBUL.

4. https://www.takarabio.com/learning-centers/pcr/technical-notes/colony-pcr-in-under-an-hour (Erişim Tarihi: 08.04.2019)

---