Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

Mikobakteri Kültür Yöntemleri

---

Mikroskopik muayenede ARB araştırılması, TBC tanısı için oldukça değerli, basit ve ucuz bir yöntem olup ön tanı değeri taşır. Fakat tüberkülozun kesin tanısı için etken ajanın kültür ortamında tekrar gösterilmesi ve bazı in vitro testler ile doğrulanması gerekir. Kültür yöntemi; M.tuberculosis için “altın standart” olarak kabul edilmektedir. Mikobakterilerin üretilmesinde çalışılacak laboratuvar ortamının imkanları ölçüsünde standart besiyerlerinden MGIT, BACTEC gibi komplike sistemlere kadar farklı kültür yöntemleri uygulanabilir.

Mikobakterilerin izolasyonu için ideal ortam;

Az sayıdaki mikobakterilerin hızlı ve bol miktarda üremelerine izin vermeli,
Ekonomik olmalı, içeriğinde bulunan maddelerin temininde ve hazırlanmasında zorluk yaşanmamalı,
Pigment oluşumu ve koloni morfolojisine dayanarak izolatlar arasındaki farklılıkları saptamaya yardımcı olmalı,
Mikobakteri dışındaki kontaminant mikroorganizmaların üremesini inhibe etmeli,
İlaç duyarlılık testleri uygulamak için uygun olmalıdır.
Tüberkülozda kullanılan standart besiyerleri değişik başlıklar altında toplanabilir:

İçerikleri yönünden;

Sentetik besiyerleri (Sauton, Long vb.)
Yarı sentetik besiyerleri (Yumans, Dubos, Middlebrook vb.)
Kompleks besiyerleri (Löwenstein Jensen, Ogawa, Trudeau)
Görünüm yönünden

Katı besiyerleri (Yumurtalı ve agarlı; Löwenstein Jensen, agarlı Middlebrook, Treduau vb.)
Sıvı besiyerleri (Middlebrook, Youmans, Sula vb.)
Karışık besiyerleri (Gliserinli, patatesli buyyon vb.)
Kullanım amacına göre

Primo kültür - ilk izolasyon (Löwenstein Jensen, agarlı Middlebrook, Trudeau, Ogawa vb.)
Araştırma
Üretim (Tüberkülin, BCG; Sauton, Proskauer, Long vb.)
Antimikrobiyal madde içeriğine göre

Nonselektif: Antibiyotik içermezler.
Selektif: Antibiyotik içerirler.
Günümüzde mikobakterilerin ilk izolasyonunda en sık kullanılanlar yumurtalı besiyerleri ve/veya agarlı besiyerleridir. Agarlı besiyerlerine göre yumurtalı besiyerlerinin hazırlanması daha zahmetli fakat daha ucuzdur ve koloni görüntüsü daha tipiktir. Bu nedenle Türkiye dahil Tüberküloz hastalığının sık görüldüğü ülkelerde en sık yumurtalı besiyerleri, bunlardan da en sık Löwenstein Jensen besiyeri kullanılmaktadır. Yine yumurtalı ve katı olan Ogawa besiyeri de basit ve ucuz bir besiyeridir. Uzak Doğu’da özellikle Japonya’da kullanılır. Amerika’da yumurtalı besiyeri olarak Treduau ve ayrıca agarlı besiyeri olarak Middlebrook 7H10 ve 7H11 en sık kullanılan besiyerleridir. Petragnani besiyeri özellikle yoğun kontamine örneklerden mikobakteri izolasyonunda tercih edilir. American Thoracic Society Medium (ATSM), diğerlerine göre daha düşük oranda malaşit yeşili içerdiğinden özellikle BOS, plevra sıvısı, biyopsi gibi steril örneklerde tavsiye edilir. Löwenstein Jensen besiyerinin klinik örneklerden mikobakteri izolasyonundaki duyarlılığı; üreme zamanının daha uzun olması, koloni oluşumunun daha geç tespit edilmesi gibi nedenlerden dolayı, Middlebrook 7H10, 7H11 ve sıvı formu (broth) olan 7H9 besiyerleri ile karşılaştırıldığında daha düşüktür.

Balgam kültürlerinde ilk seçenek yumurtalı besiyerleridir. Balgam dışı örneklerde ise en verimli yöntem sıvı besiyerlerini kullanmaktır. Ekonomik yeterliliği olan laboratuvarlarda özellikle BOS, vücut boşluk sıvıları ve biyopsi gibi tekrarlanamayan örneklerde sıvı besiyerlerinin kullanılması tavsiye edilmektedir.

Yumurtalı Besiyerleri

Avantajları

1. Hazırlanması kolaydır.

2. Mevcut en ucuz besiyeridir ve tüberküloz bakterisinin iyi üremesine müsaade eder.

3. Taze yumurtadan hazırlandığı, sıkı kapaklı tüplerde saklandığı ve buharlaştırarak sıvı artığının minumuma indirildiği durumlarda haftalarca buzdolabında saklanabilir.

4. Tüplere dağıtıldıktan sonra koagüle edildiğinden ve ayrıca eklenen malaşit yeşili mikobakteri dışındaki diğer bakterilerin üremesini engellediğinden kontaminasyon riski düşüktür.

Dezavantajları

1. Pozitifliğin saptanma süresi uzundur. Özellikle örnekte az sayıda bakteri bulunması ya da güçlü dekontaminasyon işlemi uygulanması durumunda belirgin kolonilerin izlenmesi 6-8 hafta gibi uzun bir süreyi alabilir.

2. Kontaminasyon durumunda çoğu kez besiyerinin tüm yüzeyi etkilendiğinden sıklıkla besiyeri kaybedilir.

Besiyeri Hazırlarken Dikkat Edilmesi Gereken Kurallar:

İyi kalitede bir besiyeri elde etmek için kullanılan kimyasal maddelerin saf olması, cam malzemelerin ve distile suyun steril olması gerekir. Besiyeri hazırlama yönteminde yer alan kurallar aynen uygulanmalı, değişikliklerden kaçınılmalıdır.

1. Çalıştığınız ortamı mümkün olduğu kadar temiz tutunuz. Tezgahın üzerini uygun bir dezenfektan (1/10 ya da 1/20 oranında sulandırılmış çamaşır suyu gibi) ile siliniz. Yerleri toz oluşmasını engellemek için nemli bezlerle siliniz.

2. Cam malzemeleri ve diğer aletleri steril ettikten sonra kullanınız.

3. Kimyasal maddelerin tavsiye edilen saflıkta olmasına dikkat ediniz.

4. Koagülatör ısısını önceden kontrol ediniz.

5. Asepsi kurallarına özenle uyunuz (tüplerin ve şişelerin ağzını alevden geçirme vb.).

6. Yumurtaların kabuklarını kırmadan önce mutlaka temizleyiniz.

7. Koagülasyonda tavsiye edilen ısının ve sürenin üzerine çıkmayınız.

8. Hazırlamış olduğunuz besiyerlerini ışıklı ortamda (özellikle UV altında) tutmayınız. Buzdolabında saklayınız (Buzdolabı ışığının kapak kapatıldıktan sonra söndüğünden emin olunuz).

9. Tüplere dağıtım aşamasında besiyeri hacmini kullandığınız tüplere göre ayarlayınız (6-8 ml küçük şişelere, 20 ml deney tüpüne). Gereksiz tasarruflardan kaçınınız.

LOWENSTEIN - JENSEN BESİYERİ HAZIRLANMASI

Tuz Solüsyonu
Monopotasyum Fosfat 2400 mg
Magnezyum Sülfat 240 mg
Magnezyum Sitrat 600 mg
L- Asparagine 3600 mg
Gliserin 12 ml
Distile Su 600 ml

Yukarıdaki maddeler tartılıp büyük bir balona konularak eriyinceye kadar benmaride kaynatılır. Otoklavda 121oC’de 30 dakika sterilize edilir.

Besiyeri İçin Gerekli Yumurtanın Hazırlanması

1. Önce, 2 gr malaşit yeşili tartılır, 100 ml distile su içinde eritilir. Bu şekilde hazırlanmış % 2’lik malaşit yeşili stok çözeltisi koyu renkli bir aktarılır, güneş ışığından uzak bir yerde muhafaza edilir.

2. 25 adet sağlam, taze yumurta alınır, üzeri kirli olanlar sabunlu suyla iyice fırçalanır. Yumurtalar geniş bir kaba konulur. Steril bir kapta UV lambası altında 45 dakika bekletilerek sterilize edilir. UV lamba yoksa yumurtalar, %70’lik etil alkol ile doldurulmuş geniş ve derin bir kapta 15 dakika bekletilir.

3. Bu sterilize edilmiş yumurtalar, ağzı lastik tıpa ile kapatılabilen steril bir balona, steril huni vasıtasıyla kırılır. Balonun ağzı kapatılarak balonda toplanan yumurtalar homojen hale gelinceye kadar çalkalanır. Daha önce hazırlanıp steril edilmiş büyük balondaki tuz solüsyonuna steril bir tülbentten süzülerek ilave edilir.

4.Bunun üzerine % 2 lik malaşit yeşilinden 25 ml ilave edilir, hepsi birlikte çalkalanır.

5. Özel tevzi (dağıtım) cihazları ile 6-8 ml hacimlerde, 160x16 mm’lik tüplere steril şartlarda dağıtılır.

6. Aral Gürsel sulu tip koagülatörde 78-80oC’de 1 saat koagüle edilir.

7. Koagüle edilen besiyerleri, 37oC’lik etüvde 24 saat bekletilir. Ertesi gün kontamine olmuş besiyerleri ayrılır. Steril ve sağlam olan besiyerleri 2-8oC’de (buzdolabında) saklanır. İlaçlı Löwenstein-Jensen besiyerlerinin raf ömrü 2 ay; ilaçsız (normal) Löwenstein-Jensen besiyerinin (kurumasına mani olunduğu taktirde) raf ömrü ise 6 aydır.

8. Ticari olarak baz Lowenstein-Jensen besiyeri temin edilebilir. Bunlarda benzer şekilde hazırlanır. Ancak bu besiyerleri patates unu içerdiğinden ilaçlı besiyeri yapımında kullanılmaz.

SIVI KÜLTÜR SİSTEMLERİ

Solid besiyerlerine göre mikobakterilerin, daha kısa sürede üremesine olanak sağlarlar. Bactec ve MGIT sistemleri bu amaçla kullanılmaktadır.

BACTEC

Bactec yöntemi sıvı besiyerinde üreyen mikobakterinin üremesinin radyometrik olarak izlenmesi esasına dayanır.Temel prensip 14C ile işaretli substrat içeren besiyerinde bu substratı kullanarak üreyen mikobakterilerin 14CO2 üretmesidir. Tespit edilen 14CO2 miktarı vial içindeki üremenin miktarı ve oranını yansıtır ve üreme indeksi olarak tanımlanır. İlaç duyarlılık testleri Bactec sistemi kullanılarak yapılabilir.

MGIT

MGIT yöntemi mikobakterilerin klinik örneklerden (kan ve idrar hariç) hızlı izolasyonunu optimize etmek için geliştirilmiş in vitro bir sistemdir. Hastalardan alınan örnekler işlendikten sonra MGIT tüplerine inoküle edilir. MGIT tüplerinin dip kısımlarında fluorescent içeren silikon bulunur ve sıvı besiyerinde bulunan çözünmüş haldeki O2 varlığına duyarlıdır. Sıvı besiyerinde üreyen mikobakterilerin açığa çıkardığı çözünmüş haldeki oksijen floresan açığa çıkarır ve üremenin tespit edilmesini sağlar.

---