Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

Sefaleksinli Bordet-Gengou agar (C-BGA)

---

1 BGA agar baz yukarıda “A”da veya “B”de tarif edildiği gibi hazırlanır, otoklavlanır ve 55°C‟ye soğutulur.
2 Sefaleksin suplement besiyerine at kanı ilavesi aşamasında ilave edilir.
(a) Bunun için derin dondurucudan sefaleksinin 10mg/mL stok* solüsyonu önceden çıkarılmış ve oda ısısına getirilmiş olmalıdır.
*NOT: 10 mg/mL‟lik sefaleksin stok solüsyonunun hazırlanışı için bkz. Ek-2.
(b) Besiyeri karıştırılırken stok solüsyondan 1 mL -aseptik olarak- besiyerine eklenir.
3 Yukarıda “A” nın altında verilmiş olan 3-12. basamaklar burada da uygulanarak CBGA besiyerinin hazırlanması tamamlanır.

A - Prensip
Bir besiyerinin seçici olması, besiyerine, üremesi istenen bakterinin dirençli, diğerlerinin ise duyarlı olduğu antimikrobiyal (bazen de tellürit, boya vb.) maddelerin eklenmesi ile sağlanır. Besiyerindeki antibiyotik konsantrasyonu kritik öneme sahiptir. Konsantrasyon arttıkça izole edilmek istenen bakteri üzerindeki inhibitör etki de artabilir. Konsantrasyon düşük kaldığında ise istenmeyen bakterilerin üremesi artar. Bu nedenle antibiyotik tartımı, hazırlanması ve saklanmasında maksimum hassasiyet gösterilmesi önem kazanır.
Besiyerlerine konacak antibiyotikler besiyerinin 1 litresinde bulunması gereken miktarın 1 mL içinde sulandırılması prensibine göre hazırlanır. Bu şekilde hazırlanan antibiyotik (stok solüsyon) -20°C‟de saklanır.

B - Gereç, donanım

• Hazırlanacak antibiyotik
• Membran filtre (enjektör ucu tipte, 0.2 μm por çağlı)
• Tüpler, steril, burgu kapaklı (50 mL)
• Derin dondurucu tüpleri, steril (1.5 mL)
• Biyogüvenlik kabini
• Hassas terazi (0.001 g)
• Otomatik pipetler
• Derin dondurucu (-20°C, -85°C)

C - Formül, tartım

Tartım için şu formül kullanılır:

Tartılacak miktar (mg) x Aktivite (μg/mg)
----------------------------------------- İstenen konsantrasyon (μg/mL)
Volüm (mL)

• Ambalajı üzerinde “aktivite” değeri belirtilmemiş antibiyotikte aktivite 1000μg/mg olarak kabul edilir.
• “Tartılacak miktar” terazinin hassasiyet kapasitesine göre kararlaştırılır.
• Hassas terazi en az 0.001g hassasiyette olmalıdır. Böyle bir hassas terazide bir kerede güvenli olarak tartılabilecek en küçük miktar 20 mg'dır. Daha düşük ağırlıkta tartımdan kaçınılmalıdır.
• Örneğin; 1 mg/mL‟lik antibiyotik stok solüsyon yapmak için en az 20 mg tartım yapmak gereği göz önüne alınırsa -aktivite de (μg/mg) hesaba katılınca- en az 20 mL dilüent ile sulandırım yapılacağı hesaplanır. Bu miktar yaklaşık 20 L besiyeri içindir.

D - Stok antibiyotiğin hazırlanması

• Tartılacak miktar belirlenip istenen konsantrasyona göre sulandırım volümü hesaplandıktan sonra, antibiyotik tartılır.
• Dilüenti ile sulandırılır. Dilüent çoğu kez “su”dur; ancak bazı antibiyotikler HCl veya diğer bazı çözücüler içinde eritilebildiğinden, dilüentin antibiyotiğe göre değişebileceği akılda tutulmalıdır.
• Eritilmiş antibiyotik stok solüsyonu membran filtre ile steril edilir.
• Önceden etiketlenip hazırlanmış 1.5 mL‟lik steril tüplere, her 1 L besiyeri için 1 mL olacak şekilde (ya da tüp çeperine bulaşacak miktar da hesaba katılarak, 1.1 mL) dağıtılır.

NOT: Eğer besiyeri daha az miktarlarda dökülüyorsa alikotlar da buna göre daha küçük tutulabilir. Örneğin; 250 mL besiyeri için 250 μL stok antibiyotik gerekir; bu durumda tüp çeperine bulaşacak miktar hesabıyla 300 μL‟lik alikotlar hazırlamak iyi olur.

• Tevzi edilmiş antibiyotik solüsyonu derin dondurucuda 2 yıl saklanabilir.

E - Sefaleksin stok solüsyonu (10mg/mL) hazırlama

1 Biyogüvenlik kabini* en az 10 dk önceden açılır, çalıştırılır. Çalışma yüzeyi alkolle temizlenir. Gerekli malzeme (tüpler, enjektör, filtreler…) çalışma alanına yerleştirilir.
2 Tartım miktarına göre yeterli sayıda (ör., 20 adet) steril 1.5 mL‟lik derin dondurucu tüpü alınır ve şu bilgiler yazılarak etiketlenir:

• Sefaleksin 10 mg/mL
• Miktarı 1.1 mL
• Hazırlama tarihi (o günün tarihi)
• Son kullanma tarihi (2 yıl sonraki o günün tarihi)

3 Açıldığı tarihte ambalaj üstünde belirtilen aktivite ör., >900 μg/mg olsun; tartılacak miktarın 200 mg olmasına karar verdiğimiz varsayılsın.
4 Besiyerinde sefaleksinin son konsantrasyonu = 10 mg/L olması istendiğine göre „Stok Sefaleksin‟ = 10 mg/mL (10.000 μg/mL) olacak şekilde hazırlanacaktır. Yukarıda “C - Formül, tartım” başlığının altında verilen formüle koyulduğunda:

200 mg x 900 μg/mg = 10.000 μg/mL
--------------------------------    Volüm = 18 mL bulunur
Volüm

5 Toz antibiyotikten 200 mg tartılır ve dikkatli bir şekilde 50 mL‟lik temiz bir erlene konur. Üzerine 18 mL distile su ilave edilir. Bu esnada tartım kabı da suya tutulur ve üzerinde hiç madde kalmaması sağlanır.
6 Antibiyotik tümü ile eriyene kadar yavaş yavaş karıştırılır.
7 Solüsyon enjektöre alınır ve 0.22 μm membran filtre ile steril bir tüpe süzülür. Bu tüpten de steril pipet yardımıyla derin dondurucu tüplerine 1.1 mL‟lik alikotlar halinde (1 L besiyerine 1 mL koymak üzere; fazla 0.1 mL tüpe bulaş vb payı için) tevzi edilir.
Yukarıda verilen ölçülere göre toplamda 17 litre besiyerine yetecek kadar sefaleksin stok hazırlanmış olur.
8 Tüpler, önce supor ile derin dondurucuya kaldırılır ve -20°C‟de dondurulur. Donduktan sonra tüpler (fazla yer kaplamaması için) üzeri etiketlenmiş kapaklı bir kaba veya kutuya aktarılır ve -20°C‟de saklanır.

---