Serumda bilirubin tayini

Kullanılan Metot: Modifiye Malloy Eveleyn, Vander Berg

Prensip: Plazma veya serum Ehrliich (Diazo) ayıracı (diazotize sülfanilik asit) ile reaksiyona sokulur. Ortamdaki bilirubin, ayıraçla reaksiyona girer ve bilirubin miktarı ile doğru orantılı olarak renkli bir bileşik ( pembe- kırmızı) olan azobilirubini oluşturur. Renk 2 saat kadar dayanıklıdır. Oluşan azo bilirubinin optik dansitesi spektrofotometrede ölçülerek bilirubin miktarına çevrilir.

Kullanılan Ayıraçlar

o Diazo A ayıracı: 1 gr sülfonilik asit üzerine 15 ml yoğun HCI eklenir. Süzülür ve distile su ile litreye tamamlanır. Uzun zaman dayanıklıdır.

o Diazo B ayıracı: 0,5 gr NaNO4 suda çözünerek distile su ile 100 ml‟ye tamamlanır. Işıktan korunmalı ve renk sarıya dönünce atılmalıdır.

o Diazo ayıracı: Analizden hemen önce 10 ml diazo A ve 0,3 ml diazo B karıştırılarak taze hazırlanır.

o Metil alkol (metanol)

o %1.5’lik HCI: 15 ml yoğun HCI distile su ile bir litreye tamamlanır. Ayıraç uzun süre dayanıklıdır.

o Bilirubin stok standart çözeltisi: 10 mg bilirubin 100 ml‟lik balon içerisinde bir miktar kloroform ile çözülür ve kloroform ile 100 ml‟ye tamamlanır. Koyu renkli şişede ve buzdolabında saklanır.

o Bilirubin çalışma standart çözeltisi: 10 ml stok çözeltiden alınarak metil alkol ile 100 ml‟ye tamamlanır. Bunun 1 ml‟sinde 0,01 mg (yada 1 mg/dl) bilirubin vardır.

- Standart eğrinin çizilmesi: Metil alkol kullanılarak bilirubin stok standart çözeltisinden (%10 mg) %0.1 mg, 0,5 mg, 1 mg, 2 mg ve 3 mg‟lık standart çözeltiler hazırlanır. Bu standart çözeltilerden 9 ml ve kör için 9 ml metanol alınır. Üzerlerine 1‟er ml diazo ayıracı eklenir ve oda ısısında 30 dakika bekletilir. Sürenin sonunda 540 nm‟de spektrofotometrede optik dansiteler okunur. Sonuçlar, bilirubin konsantrasyonları ile birlikte milimetrik kâğıda işlenir ve standart eğri çizilir. Test sonuçları % mg (ya da mg/dl) olarak bu eğriden hesaplanır.

Kullanılan Teknik

o Serum taze ve hemolizsiz olmalıdır.

o 1 ml serum alınır ve distile su ile 10 kez sulandırılır.

o İki deney tüpü alınır, kör ve test olarak işaretlenir.

o Kör işaretli tüpe 5 ml metanol ve 1 ml % 1,5 HCI,

o Test işaretli tüpe 5 ml metanol ve 1 ml diazo ayıracı konur, karıştırılır.

o Kör ve test işaretli tüplere daha sonra 4‟er ml sulandırılmış serum eklenir.

o Karıştırılır ve oda ısısında 15 dakika beklenir.

o Daha sonra 540 nm‟de köre karşı testin absorbansı okunur.

MEB Laboratuvar Hizmetleri Aralık 2015

#serumda #bilirubin #tayini