streptavidin-biyotin metodu
İMMÜNHİSTOKİMYASAL BOYAMA YÖNTEMİ
%10 formalinde fikse edilmiş, parafine gömülü dokulardan, 3-5 mikron kalınlığındaki kesitler, adeziv (polilizin) kaplı lamlara alınır
İmmünhistokimyasal boyama işlemi, antikor üreticisinin uygun gördüğü “streptavidin-biotin peroksidaz” yöntemi kullanılarak yapıldı.
Kesitler, deparafinizasyon için 56 °C’lik etüvde 1 gece bekletildikten sonra 2 defa 15’er dakika süreyle ksilene alınır. Bunu takiben sırasıyla, mutlak alkol, %80 ve %70’lik alkolde, 10’ar dakika bekletildikten sonra distile suya indirgenerek rehidrate edilir.
Mikrodalga fırında, “high power” düzeyinde 4 defa 5’er dakika sitrat buffer (pH: 6) uygulanarak antijen ortaya çıkarma (retrieval) işlemi yapılır. Aralarda, buharlaşarak eksilen solüsyon distile su ile tamamlanır. Lamlar, 20 dakika süreyle oda ısısında bekletilerek soğutulur. Daha sonra distile su ile yıkanır.
Lamlardaki dokuların etrafı, doku sınırlayıcı “PAP pen” kalemle çizilir. Dokudaki endojen peroksidaz aktivitesini ortadan kaldırmak amacıyla kesitler, %3’lük hidrojen peroksit solüsyonunda 10 dakika bekletilir. Daha sonra distile su ile 5 dakika süreyle yıkanır ve pH’ ı 7,2 olan PBS (Phosphate-buffered saline) solüsyonunda 5 dakika süreyle yıkanır. Non-spesifik immünreaktiviteyi ortadan kaldırmak için, 10 dakika süreyle “UV blocking” işlemi uygulanır. Sonrasında yıkama yapılmadan, solüsyon dokuların üzerinden uzaklaştırılır.
Bundan sonra, dokulara, primer antikor olarak, VEGF antikoru damlatılan kesitler 30 dakika, CD105 antikoru damlatılan kesitler 60 dakika oda sıcaklığında bekletilir. Daha sonra, distile su ile 5 dakika yıkanarak PBS solüsyonunda 10 dakika süreyle, daldır-çıkar yöntemiyle yıkanır.
33
Bundan sonra, tüm kesitlere, sekonder antikor olan biotin damlatılarak 20 dakika beklenir. Böylece, primer antikorların bağlandığı antijenler işaretlenmiş oldu. Lamlar daha sonra, önce distile su ile 5 dakika, ardından PBS ile 5 dakika yıkandır. Streptavidin damlatılarak 20 dakika beklenir ve yine önce distile su ile 5 dakika, ardından PBS ile 5 dakika yıkanır. Streptavidin, primer antikora bağlı biotin’ in görünür hale gelmesini sağlamış olur. Bundan sonra kesitlere AEC (amino etil karbazil) kromojen (ScyTek®) uygulanarak 15 dakika bekletilir. Distile suda 5 dakika yıkama sonrasında Mayer hematoksilen ile 15 dakika boyunca zıt boyama yapılır. Kesitler daha sonra, çeşme suyunda yıkanarak su bazlı bir kapatıcı ile (Aqueous-Mount, ScyTec®) ile kapatıldı.
Histoloji
-
Endosülfan ve okratoksin-A’nın birlikte sıçanlarda toksisitesi: histopatolojik değişiklikleri
-
Histoloji Pdf Ders Notları
-
DEKALSİFİYE EDİLMEMİŞ KESİTLERİN HAZIRLANIŞI
-
DEKALSİFİKASYONU TEST ETMEK
-
KELATLAMA AJANLARI
-
ELEKTROLİTİK DEKALSİFİKASYON
-
ASİT DEKALSİFİKASYON SIVILARI
-
Histopatoloji nedir ?
-
KEMİK DOKUSU VE DEKALSİFİKASYON
-
MSS’DE DEJENERE MİYELİNİN GÖSTERİMİ
-
MARKSCHE’DEN BOYASI (Spielmayer, Benda)
-
MSS‘DE MİYELİNİN GÖSTERİMİ
-
KARIŞIK OLAN TEKNİK
-
BİELSCHOWSKY TEKNİĞİ
-
GÜMÜŞ ÇÖKTÜRME YÖNTEMLERİ