Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

Trans-Isolate (T-I) besiyeri hazırlanması

---

Katı faz için

Aktif kömür                   2 g
Nişasta (eriyebilir)        2.5 g
Agar                            10 g
0.1M MOPS* tampon (pH 7.2)  500 mL

Sıvı faz için

Triptik soya buyyon bazı     30 g
Gelatin                              10 g
0.1M MOPS tampon (pH 7.2)    500 mL
SPS                                  250 mg
Vitox veya Isovitalex        10 mL

Besiyerinin yapılışı
0.1M MOPS tamponun (pH 7.2) hazırlanması

1- MOPS tampon tozu (analitik saflıkta) 20.93 g tartılır; 900-950 mL distile su ilave edilir,eritilir; 1N NaOH ile pH 7.2‟ye ayarlanarak su ile hacim 1000 mL‟ye tamamlanır.

Katı fazın hazırlanması

2- Aktif kömür, eriyebilir nişasta ve agar tartılır; 500 mL MOPS tampon ilave edilir. Manyetik karıştırıcıda karıştırılarak ısıtılır. Agarın ve nişastanın erimesi sağlanır.
3- 20 mL‟lik serum şişelerine 5‟er ml dağıtılır.
4- 121°C de 30 dk otoklavlanır. Otoklavdan çıkarılan şişeler sepeti ile birlikte, agarın tepesi şişenin omzuna gelecek şekilde eğik konumda soğumaya bırakılır.

Sıvı fazın hazırlanması

1- Triptik soya buyyon bazı ve jelatin tartılır. Üzerine 500 mL MOPS tampon ilave edilir. Jelatinin çözünmesi için besiyeri ısıtılır, koagüle olmamasına dikkat edilir.
2- 121°C de 15 dk otolavlanır. Otoklavdan çıkarılınca oda sıcaklığına gelmesi beklenir.

T-I besiyerinin yapılması (28)

1- Bu aşama için şu olasılıklar vardır:
(a) Katı fazı içeren şişelere 5‟er mL sıvı faz besiyeri aseptik koşullarda ilave edilir.
(b) Eğer besiyeri kan kültürü için kullanılacaksa önce sıvı faza SPS eklenir. Bunun için SPS tartılır. Bir miktar (≤5 mL) MOPS tampon içinde kuvvetli bir şekilde çalkalanarak çözülür. Membran filtre (0.22 μm) ile steril edilir ve sıvı faza ilave edilir. Sonra “(a)” adımı gerçekleştirilir.
(c) Eğer T-I besiyeri H. influenzae izolasyonu için de kullanılacaksa önce sıvı faza (aseptik olarak) 10 mL IsoVitaleX veya Vitox gibi bir üreme destekleyici de eklenir. Sonra “(a)” adımı gerçekleştirilir.
(d) Alternatif olarak üreme destekleyici katmadan T-I besiyeri tamamlanır. Kullanma aşamasında ihtiyaç duyulan sayıda şişeye üreme destekleyici eklenir ki, bu durumda aseptik olarak bir şişeye 0.1 mL Vitox veya IsoVitaleX eklenmelidir.
2- Şişeler steril bir kauçuk tıpa ve alüminyum kapaklar ile kapatılmalıdır. Otomatik bir sistem mevcut değilse, alüminyum kapakları tutturmak için bir el ile sıkma aracı kullanılmalıdır.
3- Bu şekilde hazırlanmış T-I şişelerinin üzeri etiketlenerek hazırlama ve son kullanma tarihleri yazılır. Eğer kapakları iyi sıkı kapatılmış ise +4°C‟de raf ömrü en az 2 yıldır.
4- Buzdolabında saklama esnasında sıvı fazı jelatinöz hale gelebilir, ancak oda sıcaklığına getirildiğinde yeniden erir.
5- Şekil 10‟da bifazik T-I besiyeri şişeleri görülmektedir.

Besiyerinin kalite kontrolü
1- Kullanmadan önce; (i) sterilite kontrolü için 2-3 şişe inoküle edilmeksizin 35°C‟de inkübe edilmelidir; (ii) üreme kontrolü için de aşağıda verilen standart suşlar ile test edilmelidir.
2- Kontrol organizmaları (alternatifi biyokimyasal olarak tam tanımlanmış laboratuvar suşları kullanılabilir).
Neisseria meningitidis (ATCC13090)
Haemophilus influenzae type b (ATCC 10211)
Streptococcus pneumoniae (ATCC 6305)
3- Üreme kontrolü için, kontrol organizmalarından hazırlanan 104-105 cfu/mL yoğunluğundaki süspansiyonlardan şişelere 0.1‟er mL ekim yapılır. Oda sıcaklığında 18-48 saat inkübe edilir. Bulanıklık gözlenmesi üreme göstergesidir; ancak şişelerde ÇA plaklarına da çizgi ekimler yapılarak teyit edilmelidir.
4- Beklenen sonuç bütün kontrol suşlarının izole edilebilmesidir.

---