Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

Yeni Nesil Dizileme Nedir?

---

Yeni nesil dizileme (NGS), büyük ölçüde paralel veya derin dizileme, genomik araştırmada devrim yaratan bir DNA dizileme teknolojisini tanımlayan ilişkili terimlerdir. NGS kullanılarak tüm insan genomu tek bir gün içinde dizilenebilir.

Bunun aksine, insan genomunu çözmek için kullanılan önceki Sanger dizileme teknolojisi, son taslağı teslim etmek için on yıldan fazla bir süre gerektiriyordu. Genom araştırmasında NGS, çoğunlukla geleneksel Sanger dizilemesinin yerini almış olsa da, henüz rutin klinik uygulamaya çevrilmemiştir. Bu makalenin amacı, NGS'nin pediatride potansiyel uygulamalarını gözden geçirmektir.

Farklı sıralama teknolojilerini kullanan bir dizi farklı NGS platformu vardır ve bunların ayrıntılı bir tartışması bu makalenin kapsamı dışındadır. Bununla birlikte, tüm NGS platformları milyonlarca küçük DNA parçasının paralel olarak sıralanmasını gerçekleştirir. Biyoinformatik analizler, bireysel okumaları (her bireyin ayrı genom analizlerini) insan referans genomuna eşleyerek bu parçaları bir araya getirmek için kullanılır. İnsan genomundaki üç milyar bazın her biri birden çok kez dizilenerek, doğru veriler sağlamak için yüksek derinlik ve beklenmedik DNA varyasyonuna ilişkin bir içgörü sağlar. NGS, tüm genomları sıralamak için kullanılabilir veya 22.000 kodlama geninin tümü (tam bir ekzom) veya az sayıda ayrı gen dahil olmak üzere belirli ilgi alanlarıyla sınırlandırılabilir.

NGS'nin Klinik Uygulamada Olası Kullanımları

NGS'yi klinik uygulamada hasta bakımını iyileştirmekte kullanmak için aşağıdakiler dahil sayısız fırsat vardır:

NGS, Sanger dizilemeden daha geniş bir mutasyon spektrumunu yakalar

Bir insan genomundaki DNA varyasyonunun spektrumu, küçük baz değişiklikleri , DNA eklemeleri ve silmeleri, eksonların veya tüm genlerin büyük genomik delesyonlarını (silinmelerini) ve inversiyonlar (ters dönmeler) ve translokasyonlar (yer değiştirmeler)gibi yeniden düzenlemeleri içerir. Geleneksel Sanger sıralaması, küçük baz değişiklikleri ve küçük eklemelerin ve silmelerin keşfi ile sınırlıdır. Kalan mutasyonlar için, konvansiyonel karyotipleme için floresan yerinde hibridizasyon (FISH) veya mikrodelesyonlar gibi submikroskopik kromozomal kopya sayısı değişikliklerini saptamak için karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) mikrodizileri gibi özel tahliller sıklıkla gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu veriler doğrudan NGS dizileme verilerinden elde edilebilir ve tek bir deneyde genomik varyasyonun tüm spektrumunu toplarken özel tahlillere olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Tek sınırlama, aşırı guanin / sitozin (GC) içeriği veya tekrar mimarisi nedeniyle kötü sekanslanan veya hatalı şekilde eşlenen bölgelerde bulunur; örneğin, Frajil X sendromu veya Huntington hastalığının altında yatan tekrarlı genişlemeler.

Genomlar önyargısız olarak sorgulanabilir

Kılcal dizileme, araştırılan gen veya lokusun ön bilgisine bağlıdır. Bununla birlikte, NGS tamamen seçici değildir ve tamamen yeni mutasyonları ve hastalığa neden olan genleri keşfetmek için tüm genomları veya eksomları sorgulamak için kullanılır. Pediatride bu, açıklanamayan sendromların genetik temelini çözmek için kullanılabilir. Örneğin, Wellcome Trust Sanger Enstitüsü'nde NHS klinik genetik hizmetleri ile işbirliği içinde yürütülen ülke çapında bir proje olan Gelişim Bozukluklarının Deşifre Edilmesi projesi, etkilenen çocukları ve ebeveynlerini daha önce görülmemiş zararlı varyantlarını ortaya çıkarmak için sıralayarak açıklanamayan gelişimsel gecikmenin genetik temelini çözmeyi amaçlamaktadır. Bu moleküler verileri ayrıntılı klinik fenotipik bilgilerle birleştirmek, benzer klinik özelliklere sahip etkilenen çocuklarda mutasyona uğramış yeni genleri tanımlamada başarılı olmuştur.

NGS'nin artan hassasiyeti mozaik mutasyonların tespitine izin verir

Mozaik mutasyonları, döllenme sonrası bir olay olarak edinilir ve sonuç olarak, bir bireyin hücreleri ve dokuları içinde değişken sıklıkta bulunurlar. Kapiler dizileme, teknolojinin hassasiyetinin altına düşen bir incelikle sıklıkla ortaya çıktıklarından bu varyantları gözden kaçırabilir. NGS sıralaması, çok daha hassas bir okuma sağlar ve bu nedenle, mozaik varyasyon da dahil olmak üzere hücrelerin sadece yüzde birkaçında bulunan varyantları tanımlamak için kullanılabilir. Ek olarak, NGS dizilemenin hassasiyeti, basitçe sıralama derinliği artırılarak daha da artırılabilir. Bu, anne kanından fetal DNA'yı sorgulamak veya kanser hastalarının dolaşımından tümör hücrelerinin seviyelerini izlemek gibi çok hassas araştırmalar için NGS kullanılmasında görüldü.

Mikrobiyoloji

NGS'nin mikrobiyolojideki ana faydası, patojenlerin geleneksel karakterizasyonunu morfoloji, boyama özellikleri ve metabolik kriterlerle patojenlerin genomik bir tanımıyla değiştirmektir. Patojenlerin genomları, ne olduklarını tanımlar, ilaç duyarlılığı hakkında bilgi içerebilir ve enfeksiyon salgınlarının kaynaklarını izlemek için kullanılabilecek farklı patojenlerin birbirleriyle olan ilişkileri hakkında bilgilendirir. Son olarak, NGS, Birleşik Krallık'taki bir yenidoğan yoğun bakım ünitesinde bir metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) salgınını ortaya çıkarmak ve izlemek için kullanıldığında medyanın ilgisini çekti. En dikkat çekici olan şey, rutin mikrobiyolojik gözetimin birkaç ay içinde meydana gelen MRSA vakalarının ilişkili olduğunu göstermemesiydi. Bununla birlikte, patojenlerin NGS'si, MRSA izolatlarının (izole edilen mikroorganizma popülasyonu) kesin karakterizasyonuna izin verdi ve tek bir personel üyesine kadar izlenebilen uzun süreli bir MRSA salgınını ortaya çıkardı.

Onkoloji

Kanser genomiklerinin temel dayanağı, kansere bedensel olarak edinilmiş mutasyonların neden olduğu ve sonuç olarak genomun bir hastalığı olmasıdır. Kılcal temelli kanser dizilimi on yıldan uzun süredir devam etse de, bu araştırmalar nispeten az sayıda örnek ve az sayıda aday genle sınırlıydı. NGS'nin ortaya çıkmasıyla, kanser genomları artık bütünlükleri içinde sistematik olarak incelenebilir ve bu, özel bir pediatrik kanser genom projesi de dahil olmak üzere, dünya çapında birkaç büyük ölçekli kanser genom projesi aracılığıyla devam eden bir çalışma. Kanserden muzdarip çocuk için, bu, hastalığın daha kesin teşhisi ve sınıflandırılması, daha doğru prognoz ve potansiyel olarak 'ilaçlı' nedensel mutasyonların tanımlanması dahil olmak üzere birçok fayda sağlayabilir. Bireysel kanser sekanslama, bu nedenle, kişiselleştirilmiş kanser yönetiminin temelini sağlayabilir. Şu anda, klinik uygulamada kanser genomlarının NGS'sini kullanan pilot projeler devam etmekte olup, esas olarak tümörlerdeki mutasyona özgü ilaçlarla hedeflenebilen mutasyonları tanımlamayı amaçlamaktadır.

Sınırlamalar

NGS'nin klinik ortamdaki temel dezavantajı, bilgisayar kapasitesi ve depolama gibi gerekli altyapının oluşturulması ve ayrıca sonraki verileri kapsamlı bir şekilde analiz etmek ve yorumlamak için personel uzmanlığı gerekmesidir. Ek olarak, klinik açıdan önemli bilgileri açık ve sağlam bir arayüzde çıkarmak için veri hacminin ustaca yönetilmesi gerekir. NGS'nin gerçek dizileme maliyeti ihmal edilebilir düzeydedir. Örneğin, son teknoloji ürünü bir NGS platformu, yaklaşık 1000 £ karşılığında yaklaşık 150.000.000 okuma üretebilirken, tek bir Sanger okuması tipik olarak £ 1'den daha düşük maliyetlidir. Bununla birlikte, NGS'yi uygun maliyetli hale getirmek için, bölge-üstü merkezileştirme gerektirebilecek büyük miktarlarda numune çalıştırılması gerekecektir. İlk sermaye yatırımını takiben, bir NGS tesisinin kapasitesi, hasta bakımındaki iyileştirmelere ek olarak ekonomik faydalar sunması muhtemel ulusal ölçekte bir hizmet sağlayabilir.

Çeviren ve Derleyen: Rumeysa Yavilioğlu

Kaynak: 

Behjati, S., & Tarpey, P. S. (2013). What is next generation sequencing?. Archives of Disease in Childhood-Education and Practice, 98(6), 236-238.

---