ANTİSENS TEKNOLOJİSİ
ANTİSENS NEDİR
Sense, m-RNA veya DNA molekülünün 5’- 3’ ipliğidir. Sense’in komplementeri olan iplik de antisens olarak isimlenir.
ANTİSENS TEKNOLOJİSİ
Antisens teknoloji insan, hayvan ve bitkilerdeki hastalıkların daha spesifik tedavisi ve yeni keşifleri için ayrıca, fonksiyonel genomik çalışmalar için çok güçlü silahlardan oluşan uygun tekniklerdir
Doğal olarak oluşan bu mekanizma sekansa spesifik olup ilk kez Caenorhabtidis elegans nematodunda keşfedilmiştir.
Prensip :
Antisens teknoloji olarak bilinen yöntemde, antisens RNA moleküllerinin hedef genin RNA(sense) ipligine spesifik olarak bağlandıgında system bu çift helix’I yabancı olarak algılar ve hatalı m-RNA molekülü daha translasyona girmeden parçalanaıp yok edilecektir ve gen ifadesinin moleküler düzenlenişine engel olunacaktır.
Yani Antisens teknolojisi ile oluşmuş olan proteinin inhibisyonu degil proteinin oluşmadan önceki transkripsyon veya translasyon aşamasının inhibisyonu amaçlanır.
Antisense teknolojisi proteinle ilgili hastalıkların ilerlemesini durdurmak için oligonükleotidler olarak adlandırılan sentetik DNA ve RNA segmentlerinin kullanımını içerir.
Artık günümüzde bir proteinin aminoasit zinciri bilindiginde DNA’nın anmalı geri çevrilebilir vem-RNA sını hedef alacak bir antisense oligonukleotid dizayn edilebilir.
Bu teknoloji ile ADIS, Kanser, Hepatid gibi tedavisi mumkun olmayan hastalıklara belki careler bulunacaktır.
Anitsens ipliğinin bugun gelişritlen en son hipotezleri
RNA splicing’in bloke edilmesi
RNA molekülünün azalmasının hızlandırılması
HnRNA intronlarının kesilmesi
m-RNA nın sitoplasmaya taşınmasının engellenmesi
Translasyonun engellenmesi
Triplex DNA oluşumunun saglanması
Atisense RNA
E.coli’deki ColE1 ve R1 plasmidleri ile yapılan çalışmalar esnasında bu plasmidlerin kopya sayılarını control eden plasmidlerin kodlandıgı küçük RNA regulatörleri bulunmuştur. ColE1 ile yapılan çalışmalar sırasında Antisense RNA lar hakkında önemli bulgular elde edilmiştir.
Bu plasmidde DNA replikasyonu Replikasyon orjininden başlar ve RNA primerleri açılan RNA çift iplikleri ile hibrit oluşturur. DNA polimeraz, RNA primerlerine bazları ilave ederek orjini içeren iplige komplementer olan yeni bir DNA ipligi sentezlemektedir. Sense ve antisense iplikleri komplementer olduklarına gore sense RNA primeri ve antisense RNA molekülleri de birbirlerine komplementer olup hibrit oluşturabilirler. Böylece dublex RNA primerleri plasmidin orjini ile eşleşemeyecekleri için DNA replikasyonu başlayamayacaktır.
Antisense RNAların yapısı
Doğal olarak bulunan antisense RNAlar 35-150 nukleotid arası uzunlua sahiptir ve 1-4 arasında steem-loop yapısı içerirler. Etkili antisense RNAlar 8 nukleotidli G-C bakımından zengin ilmekler içerirler. Hem gövde hem de ilmek yapısı stabilize olma durumu açısından önemlidir çunku komplementer RNA ile hızlı etkileşim için yapı iskeleti oluşturur. Ve sense ve antisense etkileşiminin bozulmasına karşı yapıyı korur.
Antisense RNAların etki mekanizmalrı antisens oligonükleotidlerinkine çok benzer.
Antisens
RNA ların etki mekanimaları şöyldedir.
antisens, RNA transkripsiyonun inhibe eder.
RNA splicing ve mRNAnın nükleustan dışarı taşınımını bloke eder.
Translasyonu inhibe eder.
Hedef mRNA ya bağlandıktan sonar RNAaz 3’ü indkleyip çift iplikli RNAnın bozulmasını sağlar.
Kalıp DNA dan oluşan antisens RNA lar plasmid ve viral vektörler ile taşınırlar. Bu hususta anrisens RNA lar antisens oligonükleotidlere gore daha avantajlıdırlar. Çünkü kendi kalıpları etkili bir şekilde hedef hücreye viral vektörler ve diğer yollarla alınırlar. Aktif formları hücre içinde farklı promotorlar tarafından kontrollü bir şekilde oluşturulur.
PROKAROTLARDA ANTİSENS RNA ARACILI REGÜLASYON SİSTEMLERİ
Plasmid sistemleri
Primer oluşum inhibisyonu
Rep translasyonu için gerekli olan lider dizinin sentezinin inhibisyonu Plazmidin konjugasyon ve post segregasyon killing proseslerinin kontrolü transpozon sistemleri faj sistemleri
Antisens Oligonükleotidler:
Anitsense oligonukleotidler genellikle 15-20 nukleotid içeren ve hedef m-RNA ya kopmlamenter olan sentetik dizilerdir.
1970 yıllarında Zamecnik ve Stephenson tarafından gösterilmiştir. Bu araştırmacılar Rous Sarcoma virusün (RSV) 35SRNA’ sının 5’ ve 3’ uçlu nükleotid sekansını kullanarak viral integrasyonda önemli olarak görünen 21 nükleotidlik tekrarlayıcı sekansları identifiye
etmişler ve viral sekansın bir kısmına komplementer olan d( AATGCTAAAATGG ) 13 mer’ lik oligonükleotidi sentezlemişlerdir. Bu sentetik oligonükleotid sekansı RSV ile enfekte olmuş fibroblast hücre kültürlerine verildiğinde, viral üretim büyük ölçüde inhibe olmuştur.
Böylece araştırmacılar önemli sekanslara hibridize olarak onları bloke eden oligonükleotidlerin viral integrasyonu inhibe ettiği sonucuna varmışlardır. Hücreye verilen bu oligonükleotide “hibridon” adı verilir.
Antisens oligonükleotid aktivitesine katkıda bulunan başlıca 2 mekanizma vardır :
Bir çok antisens oligonukleotid RnaseH enzimini active ederek active edecek şekilde dizayn edilmiştir. RNaseH; DNA-RNA heterodublexinin RNA kısmını keserek hedef m-RNA nın bozulmasını sağlar.
Rnase H kesimini teşvik edemeyen oligonukleotidler şse translasyonun ribozonlar tarafından bloke edilmesinde kullanılırlar.
Anitsense oligonukleotidlerin etkililigi :
Oligonukleotidler de antisens RNAlar ile aynı etki mekanizlarına sahiptir. Fakat bazıe eksik yanları vardır. Bunlar ;
Dagıtım özgüllüğü eksiktir In vivo da stabil kalamazlar
Karaciğer ve böbreklerde birikime yol açarlar
Düşük hücresel alınım vardır.
Hücreler içindeki etkili konsanstarasyonlar kısa süreli muhafaza olurlar.
Antisense Oligonukleotid Tipleri :
Birinci Tip oligonukleotidler :
m-RNA ya bağlanarak RnazeH aktivitesi ile translasyonu engeller.
İkinci Tip oligonukleotidler :
Ribozim aktivitesi ile Trasnlasyonu engellerler.
Üçüncü Tip oligonukleotidler:
DNA ç,ft sarmalına bağlanarak üçlü sarmal oluşturur ve Transkripsyon engellenir.
Antisense oligonukleotidler restrüksiyon endonucleazlardan nasıl korunur ?
Birinci sınıf modifikasyon, DNA ve RNA nükleotidlerindeki baz veya fosfat bağlarının değişimidir. DNA nükleotidlerinde olmayan, RNA nükleotidlerindeki 2’(OH) hidroksil grubu olan ( Riboz ) modifiye edilebilir. Bu modifikasyon, nukleaz degredasyonuna karşı bir tür kamuflajdır. Oksijen atomundan birini sülfür ile yer değiştirmişlerdir. Bu modifikasyon insan serumunda 10 saatin üzerinde nükleazlara karşı dayanıklı bir şekilde kalmış, aynı sekansa sahip modifiye olmamış oligonükleotid ancak 1 saat kalabilmiştir.
İkinci sınıf modifikasyon, Riboz şekerinin 2’ pozisyonundaki alkil modifikasyonlar içeren RNA nükleotidleridir. Bu modifikasyonların en önemli ikisi, 2’-O-metil ( OMe ) ve 2’-Ometoksi- etil ( MOE ) RNA’ larıdır. Modifikasyona uğramış antisens oligonükleotidlerin hibridizasyon afinitesi arttırılmış 3.sınıf modifikasyonlar ile hibridizasyonda termal stabilite artmış ve hedefin tanınması zenginleşmiştir. Bu tipler arasında ençok bilinen PNA’dır (1991). Şeker fosfat bağları poliamid bağları ile tümüyle değişmiştir. Bu oluşumlar stabiliteyi arttırıcı ve yüksek hibridizasyon kinetiği sağlarkan, hücreye verilimi ve RNAaz H kesim mekanizması için
elverişli değildir.
RNA İNTERFERANS (RNAi)
RNAi, bitkilerde, solucanlarda, mayalarda ve insanlar arasında yüksek oranda korunmuş, doğal olarak oluşan biyolojik bir prosestir. Hücre içinde iki bölümden oluşan bir yol izine sahiptir. Hücrede oluşan öncül dubleks RNA molekülü ilk olarak, Dicer endonukleaz ile 21- 23 nükleotidlik kısa fragmentlere ayrılır. siRNA (short interfering RNA) olarak bilinen bu effektör RNA’ lar, RNA uyarıcı protein kompleksi ile etkileşir ( RNA inducing silencing protein compleks; RISC ). Bu protein kompleksi, siRNA’nın bir ipliğini lider sekans olarak kullanarak, hedef homolog RNA’ları kesmektedir.
Bitkilerde, RNAi hücre savunmasında rol oynar; virus infeksiyonundan, transpozonlardan (sıçrayıcı gen) ve tekrarlayıcı sekansların uygun olmayan ifadelenmesinden, hücreyi korumaktadır.
Memeli hücreleri de benzer savunma sistemine sahiptir.
Hazırlayanlar
Orçun GÜNGÖR
Zübeyde HANOL
Genetik
-
İnsanlarda Kaç Kromozom Vardır?
-
Sık görülen mikrodelesyon sendromları nelerdir?
-
Bilim insanları kromozomları nasıl inceler?
-
Arkea'da Kromozomlar ve DNA Replikasyonu
-
DNA Onarım Mekanizmaları Nelerdir?
-
DNA hasarına neden olan etkenler nelerdir?
-
XYY Süper Erkek Sendromu - JACOB’S, Sendromu
-
Bitki doku kültürü çalışmaları ile haploid bitkiler elde edilebilir
-
Gram pozitif bakterilerden genomik DNA izolasyon protokolü
-
E. coli bakterisinden genomik DNA izolasyon protokolü
-
DNA’nın Keşfi
-
İnsan Genom Projesi Nedir ? Amaçları Nelerdir ?
-
Genomik mikrodizilimlerle ikilenme teşhisi yöntemi
-
Gen duplikasyonu ve amplifikasyonu nedir?
-
DNA ile RNA Arasndaki Farklar ve Benzerlikler Nelerdir