Pipetleme ve DNA Kalıbı
Pipetlemeye su ile (ilk olarak) başlanmak daha iyi olur. Daha sonra sırasıyla diğer bileşenler pipetlenir. PCR reaksiyon bileşenleri farklı bir sırada pipetlenirse sonuçlarda pek farklılık görülmez.
DNA kalıbına primer bağlanma ihtimalini azaltmak ve ilk denatürasyon basamağından önce polimerazın çalışmasını engellemek amacıyla; reaksiyon bileşenlerinin pipetlenmesi buz üzerinde yapılır ve tüpler de buz içinde tutulur.
Plazmidler laboratuvarda kullanılıyorsa; pipetleme steril hava akımının olduğu yerlerde; genomik DNA ya da fazla miktarda DNA kalıp olarak kullanılıyorsa pipetleme bençlerde de yapılabilir.
PCR’da kalıp olarak kozmidler, fajlar ya da plazmidler kullanılıyorsa, aerosol rezistant pipet tipinin kullanması gereklidir. Aksi takdirde, çoğu kez yanlış pozitif sonuçlara karar verilir (kalıp DNA miktarının amplifikasyon için yeterli olmasına rağmen). Genomik DNA benzeri kompleks DNA kalıplar kullanılıyorsa (bu durumda 10-100 ng miktarında örnek reaksiyona girer) bu tedbir gerekli olmayabilir. Yine de, her PCR reaksiyonu için aerosol rezistan pipet tiplerinin kullanılması güvenirlik açısından önemlidir.
Düşük miktarlarda(1-2 µl) kompleks DNA (genomik DNA) örneklerinin pipetlenmesi sırasında karşılaşılan diğer bir problem ise, herbir PCR tüpüne gerçekte konulan DNA miktarında meydana gelebilecek farklılıktır.
Fig. 5. Pipetleme hatasına örnek çoklu (multiplex) PCR test reaksiyonu. İki farklı genomik DNA örneği (herbiri 100 ng/µl) Mix J’li çoklu PCR karışımında kullanıldı. 11 farklı gen bölgesi (165 ve 85 bp uzunluğunda) aynı zamanda amplifiye edildi. İşaretleme radyoaktif dCTP ile, ürünlerin ayırımı da PAA jel ile yapılmıştır. A örneğinin herbirinden (1-4 nolu tüpler) 1 µl ve B örneğinin (5-8 nolu tüpler) herbirinden de 1 µl kuyucuklara yüklendi. Sol tarafta, DNA her tüpe ayrı ayrı pipetlendi. Sağ tarafta, DNA diğer PCR bileşenleri ile karıştırıldı ve bu karışım tüplere eşit miktarlarda bölündü. Sol taraf amplifikasyonlar, genomik DNA’nın 1 µl’sinin değişik miktarlarda DNA içerebildiğini işaret etmektedir. Bu durum, özellikle PCR reaksiyonlarının ve PCR niceliğinin yorumlanmasına negatif etki yapabilir. Sağ taraf amplifikasyonları birbirleriyle daha uyumludur (1-4 ve 5-8 karşılaştırılınca). Küçük
değişiklikler, termaldöndürücünün metal bloklarındaki değişik alanlarda sıcaklık farklılıklarından kaynaklanabilir.
İlk PCR Programı: Spesifik olmayan ürünler oluşturmadan, spesifik bir gen bölgesini amplifiye etmek optimal bir PCR reaksiyonu için gereklidir. Annealing sıcaklığı yeterince yüksek olmak zorundadır; bu olay reaksiyon sırasında hatasız DNA-DNA birleşimine olanak sağlar. Verilen herhangi bir primer çifti için PCR programı, primerin kompozisyonu (GC içeriği) ve beklenilen PCR ürününün uzunluğu temel alınarak seçilebilir. Bu gibi durumların çoğunda, amplifiye olması beklenen ürünler kısmen küçüktür (0.1-2 ya da 3 kb). Uzun aralıklı (long-range) PCR için (amplifiye ürünler 10-20 ya da 30 kb) ticari kitler kullanışlıdır. Taq polimerazın aktivitesi optimal sıcaklıkta (72-78 oC ) yaklaşık 2000 nükleotit/dakikadır ve reaksiyonda uzatma zamanı (extention time) uygun şekilde hesaplanabilir.
Enzim aktivitesi reaksiyon sırasında her zaman optimal olmayabilir. Amplifiye olan ürünlerin kb sayısına eşit olacak şekilde uzatma zamanı yazar tarafından uygulanır (1 kb için 1 dakika, 2 kb için 2 dakika gibi). Daha sonraları, ürünler bilindiğinde uzatma zamanı düşürülebilir.
Birçok araştırmacı, aktüel döngü başlamadan önce ilk denatürasyon basamağını 2-5 dakika uygulamaktadır. Bu olayın, hedef DNA’nın denatürasyonunu kolaylaştırdığı farzedilmektedir. Ayrıca, birçok makalede 5-10 dakikalık en son bir uzatma zamanı tanımlanmıştır (böylece son döngü sırasında başlatılan birçok PCR ürününün uzamasının devamı sağlanmış olur).
30-60 saniyelik bir annealing zamanı şimdiye kadar test edilen bütün primer çiftleri için yeterlidir. Annealin sıcaklığı primerlerin erime (melting) sıcaklığı temel alınarak seçilebilir. Bu yüzden, birçok kez kullanılan basit bir prosedürde, başlangıç annealing sıcaklığı yazar tarafından 54 oC olarak kullanılmıştır (uzunluğu 20 bp ya da daha uzun olan birçok primer için bu durum iyidir). Spesifik olmayan ürünler oluşursa bu sıcaklık artırılmalıdır. Eğer reaksiyon istenileni veriyorsa (sadece istenilen ürün sentezlenmiş ise) bu sıcaklıkta devam edilir. İki primerin birbirine yakın erime sıcaklığı ya da Tm derecesine sahip olması arzu edilir (5 oC ya da daha düşük). İki primer arasındaki Tm farklılığı yüksek ise, 5’ ya da 3’ uçta yeralan primerin uzunluğunun artırılması ile düşük Tm derecesi artırılır.
Bu çalışmada 70 ya da daha fazla primer kullanılmıştır. 94 oC lik 30-60 saniyelik denatürasyon zamanında iyi PCR ürünleri alınmıştır. Daha uzun bir denatürasyon basamağında, yüksek sıcaklıkta Taq polimerazın zamanı uzayacak ve polimeraz moleküllerinin % aktivite kaybı artacaktır.
Döngü Sayısı: Genelde, 30 döngü alışılmış PCR için yeterli olur. Döngü sayısındaki artış ürün miktarında keskin değişmeler yapmayacaktır.
Tablo. 2. İlk PCR Programının Dizaynı
İsim Sıcaklık Zaman
İlk denatürasyon 94 oC İsteğe bağlı
Denatürasyon 94 oC 30-60 sn
Annealing (bağlanma) 54 oC 30-60 sn
Extension (uzatma) 72 oC 30-90 sn
Son uzatma 72 oC İsteğe bağlı
Termal döndürücü ve PCR Tüpleri: PCR tüplerinin ve termaldöndürücünün farklı tipleri mevcuttur. Bazı potansiyel yararlı gözlemler aşağıda belirtilmeye çalışılmıştır :
Aynı PCR programı değişik termaldöndürücülerde önemli bir farklılık olmadan çalışacaktır (sıcaklık ve zaman profilleri farklı olabilir), böylece aynı primerin kullanıldığı PCR sonuçları değişik olabilir. Bununla birlikte, döngünün uygun şekilde ayarlanması ile aynı sonuçlar birçok termaldöndürücüde gözlenebilir.
Yeni birçok PCR makinesi 0.2 ml ince-duvarlı PCR tüplerine uygun hale getirilmiştir. Tüplerin bu tipleri için tüpten tüpe sonuçlardaki farklılıklar çoğunlukla ihmal edilir (plastik ve metal arasındaki ilişki iyidir, ısıtma olayıda buna yardımcı olur). Eski makine tipleri 0.5 ml ya da 1.5 ml tüplere uygundur. Şirketler arasında duvar kalınlığı ve şekilde önemsiz farklılıklar olmamasına rağmen, termaldöndürücülerin metal blokları ve tüpler arasındaki ilişki her zaman iyi olmayabilir. Çoğunlukla bu tür durumlarda amplifikasyonlar olmaz ya da çok az olur. Böyle bir duruma örnek aşağıda verilmiştir. Bazı firmalar, reaksiyon sırasında PCR tüplerinin içine yerleştiği küçük su banyolarının sıcaklığını kontrol eden makineler sunmaktadır. Bu durumda su ve plastik arasındaki termal değişim iyi olmakta, PCR sonuçlarındaki varyasyonlar en aza düşmektedir.
Fig. 6. Metal blok ve bazı tüpler arasında uygun ilişkinin kaybolmasından kaynaklanan amplifikasyon varyasyonları. PCR karışımı 9 farklı tüpte aynı bileşenleri eşit şekilde içermektedir ve tüpler termaldöndürücünün metal bloklarının farklı kuyularına yerleştirilmiştir. 2,4,5 ve 9 reaksiyonlar negativ sonuç vermiştir.
PCR PRİMERLERİNİN SEÇİMİ VE DİZAYNI
PCR için primerlerin dizaynında aşağıdaki basamaklar/yollar test edilmiştir ve yararlı oldukları kanıtlanmıştır.
Primerlerin boyutları 18-24 bp arasındadır. Büyük primerler (30-35 bp) kısa primerler ile karşılaştırıldığında bunların daha benzer döngü şartlarında çalıştıkları görülür ve bu durum PCR’ı daha da kolaylaştırır.
Tm derecesi ya da erime sıcaklığı yakın olan iki primerin kullanılması faydalıdır. İki primer arasındaki Tm farklılığı yüksek ise; düşük Tm derecesi 5’ ya da 3’ uçta yeralan primerin uzunluğunun artırılması yoluyla yükseltilebilir.
Pürin : pirimidin içeriği 1 : 1 civarında olmalıdır (%40-60 olabilir).
Primer sekansı 1-2 pürin bazıyla başlamalı ve bitirilmelidir.
Her primer çifti primer-primer etkileşimi bakımından test edilmelidir. Bu amaçla kullanılabilecek yararlı Macintosh programı “CPrimer” dir. Bu program sekansa giriş için erime sıcaklığını da verir. Bu şekilde PCR programlarının dizaynına yardımcı olur. Bazı web sitelerinin direkt olarak kullanılabilen programları aynı fonksiyonu yapabilir (erime sıcaklığının, uygun primerlerin seçilmesi gibi).
Primer sekansları; istenilen DNA sekanslarıyla ve genomda başka yerdeki gen bölgeleri ile ya da sıralı sekanslar ile benzerlikleri bakımından kontrol edilmelidir. Eğer iki gen bölgesi çok benziyor ise ( örneğin across türler); amplifiye olan gen bölgesinin 3’ ucuna spesifik olan primer en az 1-2 baz fazla olacak şekilde dizayn edilir.
Döngü şartları ve tampon konsantrasyonları her primer çifti için ayarlanabilir. Sekonder ürün oluşturulmadan istenilen gen bölgesinin amplifikasyonu spesifikleştirilmiş olur. Bu durum mümkün değil ise, primerlerin sekansları (her ikiside) 4-5 baz uzatılır ya da primer çifti tamamen değiştirilir.
REAKSiYON HACMİ
Soru: PCR reaksiyon hacmi sonuca olumsuz etki eder mi?
Cevap : Hayır. Özellikle de küçük hacimli, ince duvarlı, 0.2 ml plastik tüpler termaldöndürücünün 96 kuyucuklu metal bloklarına uygundur.
Gözlemlerin birkaçı şu şekilde sıralanabilir :
Eğer eski model termaldöndürücü kullanılıyorsa (ısıtma kapağı olmayan) PCR reaksiyonları küçük hacimlerde yapılır ve mineral yağı reaksiyon karışımlarını örtmek için gereklidir. Yağın kullanılması tüpteki sıvının hacmini artırır ve az da olsa sonucu etkiler. Ayrıca, eski termaldöndürücülerde büyük, kalın duvarlı plastik tüplerin kullanılması gerekiyorsa metal bloklara yerleştirme olayında düzensizlikler oluşur ve PCR sonuçlarında değişkenlik ihtimali artabilir.
96 kuyucuklu metal bloklar için dizayn edilen küçük, ince duvarlı tüpler küçük hacimli PCR reaksiyonları için idealdir. Termaldöndürücülerin ısıtma kapağı varsa mineral yağına gereksinim yoktur. 100, 25, 5 m l karışımlar kullanılarak reaksiyonların benzer sonuçlar verip-vermediği test edilir.
Önemli bir noktayı da belirtmek gerekirse; DNA kalıbı az miktarda kullanılıyorsa az hacimli PCR’ lar çok yararlı olabilir. Kalıp DNA miktarı sabit olduğunda, genelde, reaksiyon karışımı olan 5 m l 100 m l ile karşılaştırıldığında reaksiyonun her mikrolitresindeki PCR ürün miktarı daha yüksek bulunacaktır. Böyle bir durum PCR ürünlerinin görünmesine imkan verir, bazen hacmin fazla olduğu reaksiyonlarda bantlar görünmeyebilir.
ÇOKLU PRİMER ÇİFTLERİ
Tek Gen Bölgesi Amplifikasyonu : Çoklu (multiplex) bir PCR dizaynındaki ilk basamak primer çiftlerinin seçimidir. Verilen bütün gen bölgelerinin optimal amplifikasyonunu sağlayan bir PCR programını bulmak oldukça önemlidir (Fig. 9). Böyle bir durum annealing, uzatma zamanı ve sıcaklığın ayarlanması yoluyla başarılabilir.
Çoklu Eşmolar Primer Karışımları: Sonraki basamak; her primerin eşmolar oranda kullanılmasıyla istenilen primer çiftlerinden oluşan çoklu karışımlardır. Çoklu karışımlar PCR amplifikasyonu yapabilir, önce tek primer çiftinde olduğu gibi tamamen aynı PCR programı kullanılır. Çoğu kez, bu olay bazı gen bölgelerinin tercihen amplifikasyonu ile sonuçlanacaktır. Böyle bir durumda, primer konsantrasyonunda ve döngü şartlarında ek düzenlemeler yapmak gerekli olacaktır. Gerçi, bazen spesifik olmayan ürünler tek gen PCR’ın da görülebilir (sarı ok, PCR ürün # 2), bu spesifik olmayan ürünler çoğunlukla çoklu PCR yapıldığında görülmez olur. Bu durum muhtemelen spesifik olmayan ürünleri örten birçok spesifik gen bölgesinin aynı zamanda amplifikasyonu yoluyla olur.
Döngü şartlarının Ayarlanması :
Annealing zamanı ve sıcaklık
Uzatma zamanı ve sıcaklık
Örneğin Fig.11’de uzatma sıcaklığının etkisi gösterilmektedir. Eşmolar karışımlar iki farklı PCR programı kullanılarak amplifiye edildi. Birinci programda 65 oC (sarı hat) ve diğerinde 72 oC (yeşil hat) uzatma sıcaklığı kullanılmıştır. Program A kullanıldığında genelde A, B ve D için PCR ürünlerinin miktarı daha fazladır. Bu olayda şunu göstermektedir, 72 oC uzatma sıcaklığı bazı gen bölgelerinin (pembe oklar) amplifikasyonunu negatif etkilerken, görülebilen bazı spesifik olmayan ürünler de (sarı ok) oluşturmaktadır. Aynı örneklerde kısa PCR ürünleri için daha yüksek annealing sıcaklığının kullanılması, annealing sonrası polimerazca kopyalanma şansı bulunan DNA zincirinde azalma meydana getirir. Muhtemelen bu sıcaklık DNA heliksinin stabilitesine zarar verir.
Primer Miktarı ve Tampon Konsantrasyonu: Fig. 11’de bulunan DNA ürünlerinin bazılarının amplifikasyonunu düzeltmek için primerlerin miktarları bu gen bölgelerinde 2-5 X artırıldı. Aynı zamanda, PCR tampon konsantrasyonu 2 X artırıldı. Bu modifikasyonlar çok daha etkili olmakta ve amplifikasyonu (spesifik olmayan ürünlersiz) gerçekleştirmektedir.
PCR PRİMERLERİNİN MİKTARI
Çoklu PCR Primer Konsantrasyon Değerleri: PCR reaksiyonu sırasında mevcut DNA primerlerinin miktarları sonuçları etkiler. Bir PCR reaksiyonunda primer konsantrasyonu (örneğin tek gen bölgesi amplifiye edilcekse) herbir primerden 100-500nM olacak şekilde kullanılır (primerlerin herbiri 10-25 m M arasındaki konsantrasyonlarda değişik kaynaklardan alınabilir. Çoğunlukla, 0.5-1 m l primer solusyonu 25-100 m l bir PCR reaksiyonu için yeterlidir). Eşmolar primer karışımlarının kullanıldığı çoklu bir PCR test tüpünde, tek tek primerlerin miktarı 500-15 nM arasında değişir. 14 adet primerin (7gen bölgesi için) kullanıldığı karışım A’da ve karışım B’de final konsantrasyonu, karışım A için 7000-200 nM arasında, karışım B için 5000-150 nM arasında değişmektedir. Gerçi eşmolar primer karışımları çoğu kez bütün gen bölgelerinin optimal amplifikasyonu için kullanılmaz. Bu test tüpü kaçınılması gerekli olan
oldukça düşük ve oldukça yüksek primer miktarlarının gözlenmesine imkan vermektedir.
Primer ve Kalıp Konsantrasyonu : Sınırlar dahilinde, primer konsantrasyonunda artış PCR reaksiyonlarının sonuçlarını düzeltebilir ve PCR reaksiyonlarını optimize etmede gözönünde bulundurulmalıdır. Bu suretle aşağıda Fig. 14’de kalıp DNA ve primer konsantrasyonlarındaki artış PCR sonuçlarını düzeltmiştir.
PCR TAMPONLARI
Yaygın şekilde çok kullanılan PCR tamponu sadece Tris, MgCl2 ve KCl içermektedir (örneğin Perkin Elmer Cetus). Biraz daha kompleks bir tampon önceleri DMD gen ekzonlarının çoklu reaksiyonları için öneriliyordu. Bu tamponların çoklu PCR reaksiyonunda Taq polimerazın aktivitesindeki etkileri karşılaştırıldı. Fig.15’de görüldüğü gibi, dört farklı genomik DNA kalıbı üzerinde yapılan PCR reaksiyonları, 1 X DMD tamponuna göre 1.6 X tamponunda daha etkin (daha fazla PCR ürünü ) oluşturmaktadır. Kalıp DNA ve primer bütün reaksiyonlarda aynı tutulup, aynı zamanda aynı şartlarda yapıldı. Jel üzerindeki herbir hatta ürünler eşit miktarlarda yüklendi.
Tablo. 3. PCR tamponlarının kullanılması.
10 X PCR Tamponu 5 X DMD Tamponu
500 mM KCl 83 mM (NH4)2SO4
100 mM Tris-HCl 335 mM Tris-HCl (pH 8.3)
15 mM MgCl2 33.5 mM MgCl2
Reaksiyondaki optimal 50 mM b -merkaptoetanol
dNTP konsantrasyonu 34 mM EDTA
200 m M Reaksiyondaki optimal dNTP
konsantrasyonu = 6000 m M
TUZ (KCL) KONSANTRASYONU
Birden fazla gen bölgesinin çoklu PCR amplifikasyonu için ya da başarılı PCR için (özellikle 100-1000 bp arasındaki ürünler için) tampon konsantrasyonunun 1.4 X-2 X yükseltilmesi (ya da sadece KCl konsantrasyonunun 70-100 mM civarına yükseltilmesi) reaksiyonun etkinliğini
artırmaktadır. Gerçektende KCl konsantrasyonunun etkisi test edilen herhangi bir düzenleyiciye göre (DMSO, gliserol, BSA) daha önemli bulunmuştur. Genel olarak, uzun amplifikasyon ürünleri oluşturan çoğu primer çifti düşük tuz konsantrasyonlarında daha iyi çalışırken, kısa amplifikasyon ürünü oluşturan çoğu primer çifti yüksek tuz konsantrasyonunda daha iyi çalışır. Aşağıdaki 3 figürde iyonik kuvvet artışına bağlı olarak kısadan uzuna doğru ürünlerin yoğunlukları verilmiştir. Tuz konsantrasyonundaki bir artış kısa DNA’ya göre uzun DNA’yı daha yavaş denatüre eder. Bu nedenle tercihen kısa moleküller amplifiye edilecektir. Bununla birlikte bazı primerler tampon/tuz konsantrasyonlarının geniş aralığında iyi çalışır. Farklı tampon konsantrasyonlarında çoklu reaksiyon örnekleri Fig. 16, 17 ve 18’de gösterilmektedir.
Fig 16’da gen bölgesi 6 için iki primerin erime sıcaklığı 58 oC iken, gen bölgesi 5 için erime sıcaklığı 52 oC civarındadır. Aynı iyonik kuvvette (1 X tampon) ve annealing sıcaklığında (54 oC) gen bölgesi 6 amplifikasyonunun gen bölgesi 5’in daha ilerisinden yapılması önerilir. Annealing sıcaklığını aynı tutulması sırasında, gen bölgesi 5’e primerlerin bağlanmasını artırmak için PCR tamponunun konsantrasyonunun (stringency) düşürülmesi gerekmektedir. Bu olay, KCl konsantrasyonunun (ya da tampon) artırılması ile sağlanabilir. Gen bölgesi 7 farklı bir örnektir, her iki primer gen bölgesi 6 için kullanılan (58 oC) primerler ile aynı erime sıcaklığına sahiptir. Bunlar (6 ve 7 gen bölgeleri) 1 X tamponda iyi amplifiye olmamıştır, buna karşılık tuz konsantrasyonundaki artışa cevap iyi olmuştur. Bu durum; 7. ürünün tümünün 6. ürüne göre daha düşük GC içeriğine sahip olması şeklinde açıklanabilir.
Uzatma sıcaklığına maruz bırakıldığında ürün 7’nin DNA heliks stabilitesinde azalma yapar. Yeni zincirlerin bazısı, polimeraz onları tam amplifiye etmeden önce kalıptan ayrılabilir. Tamponun (1.6 X-2 X) konsantrasyonunun azalması, yeni sentez edilen zincirlerin kalıba daha iyi bağlanmasını (yapışmasını) sağlayabilir ve polimerazın görevini sonlandırmasın imkan sağlar. Sadece KCl ya da Tris-HCl konsantrasyonunda değişkenlik olan PCR reaksiyonlarının, KCl konsantrasyonlarından etkilendikleri gösterildi. Tris-HCl konsantrasyonu, konsantrasyonun geniş aralığında reaksiyonun sonuca etki etmezken, MgCl2 konsantrasyonu az da olsa farklı etkiye sahiptir.
PCR PROGRAM DİZAYNI
Temel Prensipler : Spesifik olmayan ürünlerin oluşturmadan, spesifik bir gen bölgesinin çoğaltılması, optimal bir PCR reaksiyonu için gereklidir. Bu yüzden, reaksiyon sırasında DNA-DNA eşleşmesinin çok iyi olması için annealing sıcaklığının yüksek olması gerekir. Verilen herhangi bir primer çifti için PCR programı; primerin baz kompozisyonu (GC içeriği) ve beklenilen PCR ürününün uzunluğu temel alınarak seçilebilir. Bu durumlarda genelde amplifiye olması beklenilen ürünler kısmen küçüktür (0.1-2 ya da 3 kb). Uzun aralıklı PCR için (amplifikasyon ürünleri 10-20 ya da 30 kb) ticarı kitler avantajladır. Taq polimerazın aktivitesi, optimal sıcaklıkta (72-78 oC) yaklaşık 2000 nükleotit/dakikadır ve reaksiyonun uzatma zamanı uygun şekilde daha sonra ayarlanabilir.
Reaksiyon sırasında, enzim her zaman optimal aktivite göstermeyebilir. Uygulayıcı tarafından, uzatma zamanını (dakikada) amplifiye olan ürünün kb sayısına eşit olarak ayarlamak çoğu kez uygulanan bir yöntemdir (1 kb için 1 dakika, 2 kb için 2 dakika gibi). Sonra ürünler tanımlanınca, uzatma zamanı daha da indirilebilir.
Birçok araştırmacı aktüel döngü başlangıcı öncesinde ilk denatürasyon basamağını 2-5 dakika olarak kullanır. Bu durumunun, hedef DNA’nın denatürasyonuna daha da yardımcı olduğu ifade edilmektedir. Ayrıca, 5-10 dakikalık bir enson uzatma zamanı birçok yayında belirtilmiştir (son döngü esnasında başlayan birçok PCR ürününün ya da büyük bir kısmının uzamasının sonlanmasına yardımcı olduğu ifade edilir). Bu iki basamak farklı gen bölgeleri için test edilmiştir, ne ilk denatürasyon ne de son uzatma zamanı PCR reaksiyonunun sonucunda değişme yapmamıştır. Bundan dolayı, uygulayıcının düşüncesine göre bu basamaklar artık kullanılmayabilir.
Annealing zamanı, primerlerin erime sıcaklığı temel alınarak seçilebilir. Bazen sonuçlar beklenildiği gibi olmayabilir. Bundan dolayı, 54 oC yazar tarafından başlangıç annealing sıcaklığı olarak kullanılmıştır (20 bp civarında ya da daha fazlasında birçok primer için çoğunlukla iyi sonuç verdi). Eğer spesifik olamayan ürünler oluşursa, bu sıcaklık artırılmalıdır. Eğer reaksiyon özgül ise (sadece beklenen ürünler sentez ediliyorsa) sıcaklık olduğu gibi kullanılmalıdır.
Bu çalışma esnasında 70 ya da daha fazla primer kullanılmıştır. 30-60 saniyelik bir denatürasyon zamanı etkili ve başarılı bir PCR için yeterli görülmüştür. Denatürasyon zamanındaki bir uzama, yüksek sıcaklık altında Taq polimerazın zamanını artıracak ve polimeraz moleküllerde aktivite kayıp yüzdesini çoğaltacaktır.
Döngü sayısı. Genelde, 30 döngü PCR reaksiyonları için yeterli olacaktır. Döngü sayısındaki bir artış ürünlerin miktarında keskin bir değişim yapmayacaktır.
Annealing Sıcaklığının ve Amplifiye Olan Gen Bölgesi Sayısının Etkisi : Diğer PCR’lardan farklı olarak çoklu reaksiyonlar yeterli bir sıcaklıkta (stringent) tamamlanmalıdır. Birçok bireysel gen bölgesi 56 oC –60 oC’lik bir annealing sıcaklığında spesifik olarak amplifiye edilebilir. Deneylerin gösterdiğine göre, annealing sıcaklığının 4-6 oC düşürülmesi çoklu karışımlarda aynı gen bölgesinin birlikte amplifikasyonu için gereklidir. Bu durum aşağıda fig 19’da gösterilmektedir. Aşağıdaki ifade, tek parametrenin değiştirildiği (annealing sıcaklığı) şartlarda yapılan aynı PCR reaksiyonlarını göstermektedir. Karışım C ve C*’nün çoklu PCR amplifikasyonu için annealing sıcaklığı yaklaşık 54 oC görülmektedir. Bireysel gen bölgeleri (örneğin Y) 60 oC’ de amplifiye olabilir. 54 oC’de çoklu karışımda bazı spesifik olmayan amplifikasyonlar hala görünür. Bu durum (non-spesifik bantların
görüntüsü), spesifik gen bölgelerinin sayısını artıran aynı zamanlı amplifikasyonlar aşılır ve bu yüzden artıklar görülmez. PCR’da baz kompozisyonundaki farklılıklardan dolayı (ürünlerinin uzunluğu ya da sekonder yapısı), bazı gen bölgeleri diğerlerine göre daha etkin amplifiye olur. Birçok gen bölgesi aynı zamanda amplifiye olursa (çoklu amplifikasyon), etkin şekilde amplifiye olan gen bölgesi etkisiz amplifiye olan gen bölgelerinin ürün miktarını negativ etkileyecektir. Bu fenomen PCR reaksiyonunda enzimlerin ve nükleotitlerin kısmen sınırlı kullanımından dolayıdır. Bunun için çoklu prosedürde daha etkin amplifiye olan gen bölgesi rekabeti kazanır ve amplifiye olan ürünlerin etkinliğini azaltır. Böylece ürünlerde zayıf görüntü ya da görünmezlik oluşturur. (aşağıda Fig 19’da annealing sıcaklığında kompleks durumlar belirtilmiştir. Aynı anda amplifiye olan gen bölgelerinin sayısı ve tampon
konsantrasyonu paralel reaksiyonlarda değiştirilmişti)
Fig.19. Karışım C*, karışım C ve primer Y’nin çoklu amplifikasyonları. Annealing sıcaklığı farklı olan (48 oC, 54 oC ya da 59 oC) üç PCR programında üç farklı DNA kalıbı kullanılmıştır. Mix C* (her jeldeki ilk üç bant) ve Mix C (1 X ya da 2 X PCR tamponunda 7-12 hatlar) ve primer Y (4-6 hat, mavi ok) . Her jeldeki 1-9. hatlar 1 X PCR tamponundaki reaksiyonları gösteriyor. Her jeldeki 10-12. hatlar 2 X PCR tamponundaki reaksiyonlar gösteriyor. Her jeldeki 7-12. hatlar (1 X ve 2 X altındaki ) primer karışım C’lidir. İlk jelin sol bölgesindeki 5 ok karışım C*’nin beklenilen ürünlerini işaret etmektedir. Her jeldeki en uzun spesifik ürün kırmızı okla işaret edilmektedir. Sarı oklar, karışım C* ile karşılaştırılan karışım C’deki beklenilen 2 ekstra ürünü (toplam 7 ürün) işaret etmektedir. Mavi oklar, son iki jelde bazı reaksiyonlarda Y ürünlerinin kaybını ya da ilk jelde Y ürünlerinin pozisyonunu işaret
etmektedir. Çoklu karışım 48 oC’de birçok non-spesifik bant göstermektedir. 1 X PCR tamponunda, karışım C* de karışım C’ye göre Y ürünleri daha belirgindir. PCR tampon konsantrasyonu 1 X- 2 X aralığında bütün spesifik ürünlerin amplifikasyonuna olanak verir ve çoğu non-spesifik uzun ürünlerin yoğunluğunun azalmasına yardım eder (7-9, 10-12 hatlar karşılaştırılınca). 2 X tamponunda görülen belirgin 470-480 bp nonspesifik bant (mor ok) farklı primerlerin değiştirilmiş oranları sayesinde elemine edildi. 59 oC’de sadece Y ürünü görülebilir. Bunun olabilmesi için, 2 X tamponu kullanılmalısa ya da gen bölgesi tekbaşına amplifiye olmalıdır.
Döngü Sayısı : Primer mix C* iki farklı genomik DNA kalıbını amplifiye etmek için kullanıldı. Aynı DNA kalıbı için sonuçlara bakıldığında, bütün tüpler arasında iki genomik DNA’nın birinde daha iyi olduğunu ortaya çıkardı. Bu durum muhtemelen DNA miktarından ya da kalitesinden dolayıdır. Ürünlerin miktarları arasındaki en belirgin varyasyon 24. döngü civarındadır (etidyum bromid ile boyanan jeller için). 28-30 döngü genel olarak reaksiyonda yeterlidir. Döngü sayısının 45 üzerine çıkmasıyla çok küçük değişimler gözlenmiştir ya da hiç değişim gözlenmemiştir.Döngü sayısı 60 üzerine çıktığında küçük kantitatif faydalardan bahsedilebilir
Genel Biyoloji
-
Protista Alemi ve Genel Özellikleri
-
Hücrelerdeki farklı ve benzer yapılar
-
Ses Nedir ? Ses Nasıl Oluşur?
-
Kültürü Yapılan Fitoplankton Türleri Nelerdir?
-
Apoptoz: Programlı Hücre Ölümü Nedir?
-
Ribozom ve Protein Sentezi
-
Mikrotübüller ve İplikçikler
-
Hücre Zarları
-
Lipid Çift-Katmanın Keşfi
-
Biyoreaktör
-
Telomerler ve İnsan Telomerinin Kristalik Yapısı
-
Hücre Biyolojisinin Tarihsel Gelişimi
-
Hücre biyolojisi nedir ?
-
Biyolojik Çeşitlilik Nedir ?
-
Sinir Sistemi Yapısında Bulunan Hücre Tipleri ve Özellikleri Nelerdir?