Enzim Saflaştırılması ve nitelendirilmesi
Enzim, biyolojik katalizördür. Biyokimyasal reaksiyonları katalizleme görevini yerine getirir. Enzimin saflaştırılması ve nitelendirilmesi diğer çalışmalar için bir ön basamak niteliği taşımaktadır. Tabii ki bu işlemler için de bir planlamanın olması gerekiyor. Belirli kriterlere göre saflaştırma stratejisi belirlenmelidir. Temel kriter en düşük maliyetle, en yüksek saflık ve enzim aktivitesi elde etmektir. Bunlara göre de diğer basamaklar düzenlenir.
ENZİM SAFLAŞTIRMA STRATEJİSİ:
Öncelikle saflaştırılacak enzimin ne için gerekli olduğuna karar verilmelidir. Genel olarak bir laboratuar çalışmaları için, bir de sanayide kullanım için saflaştırma istenir. Laboratuar çalışmaları için az enzim ama saflık derecesi mümkün olduğu kadar yüksek, sanayideki kullanımı için ise çok enzim ama saflık derecesinin yüksekliği pek de fazla olmayan enzim numunesi istenir. Aktivite, yapı, yapı-işlev ilişkileri için % 80-90’lık saflık derecesi gerekmektedir. Hatta yapısal çalışmalar için bu oran % 95’den fazla olmalıdır. Aksi taktirde hatalı sonuçların normal sınırları geçmesi kaçınılmaz olacaktır. Sanayideki kullanımlar için çok düşük saflık derecesinde enzim olması yeterli olmaktadır. Ama çok miktarda enzim olmalıdır. Laboratuar çalışmaları için ise az miktarda enzim olması yeterlidir.
Strateji belirlenirken yapılması gereken hususlardan birisi de enzim kaynağıdır. Yani enzimin hangi canlıdan elde edileceğine karar verilmelidir. Bunlar bakteri, mantar, bitki, hayvan vs. olabilir. Hatta daha derinlemesine canlının belirli bir kısmı da enzim kaynağı olarak belirlenebilir. Mesela fare karaciğeri, insan kanı,...
Olmazsa olmaz şartlarından birisi de maliyet ve zamandır. Bu tür çalışmalarda kullanılan araç-gereçler, kimyasal maddeler vs. çok pahalıdır. Bunların seçimi çok iyi planlanıp eldeki imkanlara göre yapılmaya çalışılmalıdır. Kullanılabilecek alternatif yollar, araçlar, kimyasal maddeler belirlenmelidir. Yapılacak çalışmaların çok uzun süreler alacağı hesap edilerek buna göre de gerekli tedbirler alınmalıdır. Belirli yerlerde yapılacak hatalar çok miktarda zaman kaybına neden olacaktır. Bu aynı zamanda maliyetin de artması anlamına gelir ki bu da hataların en aza indirilmesi için gerekli şeylerin mutlaka yapılması gerektiğini düşündürmektedir.
Her enzimin birbirlerinden farklı özellikleri olduğu için birbirlerinden değişik yöntemlerle saflaştırılmasını zorunlu kılar. Tabi ki temel mantık aynıdır ama ayrıntılarda farklı noktaların alacağı bilinmektedir. Bu nedenle de o zamana kadar elde olan enzimle ilgili verilerin toparlanıp ortaya konması hayati öneme sahiptir. Bu verilere göre de saflaştırma basamakları ve onların sıraya konması gerçekleştirilebilir.
Dikkat edilmesi gereken en önemli hususlardan birisi de ezim aktivitesinin korunmasıdır. Ne yapılırsa yapılsın enzim aktivitesi azalacaktır. Ama bu azalışı en aza indirecek şekilde gerekli önlemler alınmaya çalışılmalıdır. Eğer aktivite kaybolursa yapılan çalışmaların hiçbir anlamı kalmaz. Enzimin özellikleri de göz önüne konularak aktivitenin korunması için gerekli şartlar optimum hale getirilmeye çalışılmalıdır. Bunlardan bazılarını şöyle sıralayabiliriz:
Enzim her zaman +4 ºC’de saklanmalıdır. Çok daha düşük sıcaklıklarda da saklanabilir ama sıcaklığın artırılıp tekrar çok düşük derecelere düşürülmesi enzimin çok daha çabuk bozulmasına neden olacaktır. Bu nedenle optimum saklama derecesi +4 ºC’dir. Aksi taktirde sürekli olarak hızlı bir şekilde aktivite kaybı olacaktır.
Her enzimin optimum bir PH derecesi vardır. PH değişimleri enzim aktivitesini önemli derecede etkileyecektir. Bu nedenle her enzim için uygun bir tampon kullanılmadır. Bu tampon enzimin aktivitesini yitirmesine belirli derece engel olacaktır.
Kullanılan araç-gereç, kimyasalların sağlıklı olması gerekmektedir. Enzimin aktif bölgesi, doğası gereği çok reaktiftir ve bu nedenle inaktivasyona çok duyarlıdır. Özellikle sülfidril grubu olan enzimlerde bu kolaylıkla görülür, zira bu gruplar hücre parçalandıktan sonra çabucak okside olur. Enzimin bulunduğu ortama gelebilecek yabancı bir madde enzimin bozulmasına neden olabilecektir. Taşıma işlemlerine bile dikkat edilmelidir. Çalkalanmadan dolayı eğer enzimin bulunduğu ortamda hava kabarcıkları bulunursa, bu enzimin oksitlenip zarar görmesine neden olabilecektir.
Metal iyonları sülfidril gruplarını inaktive edebilir. Bu nedenle tamponda EDTA gibi kompleks oluşturucu maddeler ilave edilebilir. Eğer enzimin metal iyonuna ihtiyacı varsa bu maddenin eklenmesine gerek yoktur.
BELLİ BAŞLI SAFLAŞTIRMA İŞLEMLERİ:
Enzim Kaynağından Enzimin Çıkarılması: Bu işlem her kaynak için farklı şekillerde yapılabilir. Mesela bakteri için sonikasyon kullanılırken, bitki için ezme yöntemi kullanılabilir. Saflaştırma
Santrifüjleme: Değişik basamaklarda uygulanabilecek bir işlemdir. 1. basamaktan sonra hücre organellerinin ve büyük partiküllerin uzaklaştırılması için kullanılabilir. Bunu yanı sıra amonyum sülfatla çöktürme işleminden sonra da yapılır. Çok defa başvurulabilecek bir işlemdir.
Amonyum Sülfatla Çöktürme : Belirli doygunluk derecesine göre eklenen amonyum sülfat değişik molekül ağırlığındaki enzimlerin çökmesine neden olur. Çöktürme işlemlerindeki istediğimiz aralığı bulduğumuz zaman diğer proteinlerden kurtulmuş oluruz.
Diyaliz: İstenmeyen küçük maddelerden kurtulmak için yapılan bir işlemdir.
Isıtma: Aradığımız enzimin de özelliklerini göz önünde bulundurarak belirli dereceye kadar ısıtma işlemi yaptığımızda ilgilenmediğimiz diğer bazı proteinlerden kurtulabiliriz.
İzoelektrik Noktaya Göre Çöktürme: Aranılan enzimin izoelektrik noktasına göre belli bir PH aralığında karıştırılarak çöktürme işlemi yapıldığında yine bir çok proteinden kurtulmuş oluruz.
Kolon: Saflaştırma işlemlerinden en çok saflaştırma derecesi veren işlemdir. Molekül büyüklüğü, elektriksel yük, afinite gibi değişik özelliklerden yararlanılarak hazırlanan kolonlardan numune geçirildiği zaman yüksek bir saflaştırma yüzdesi elde edilir.
Oluşabilecek Aksaklıklar: Ne kadar dikkat edilirse edilsin saflaştırma ve nitelendirme işlemlerinde aksamalar olacaktır. Mümkün olduğu kadar bu işlemlerde hataları en aza indirmek gerekir. Ama hatayı sıfıra indirmek mümkün olmamaktadır. İşte bunlardan bazıları:
Analizde yanlışlıklar olabilir. Mesela spektrofotometre ile yapılan ölçümlerde hatalar yapılabilir. Kullanılan PHmetre kalibre edilmemiş olabilir. Kullanılan araçlarda hatalı ölçümlere neden olabilecek bazı hatalar olabilir. Aynı zamanda yapılan ölçümlerde kendimizde hatalar yapabiliriz. Çalışmalar sırasında mümkün olduğunca başka şeylerle uğraşmadan sadece kendi çalışmamız üzerinde yoğunlaşmak gerekmektedir. Ölçümlerdeki küçücük hatalar çok farklı sonuçların çıkmasına neden olabilir.
Ortamın PH’sı bazı nedenlerden dolayı değişebilir. Bunu önlemek için tampon çözelti kullanılsa da yine de PH değişimlerini en aza indirecek önlemler de düşünülmelidir. Mesela reaksiyon karışımındaki tampon miktarını artırmak bunu sağlayabilir.
İnaktivasyon ilerleyen saflaştırma basamaklarında karşımıza çıkabilir. Bunu önleyecek tedbirler de alınmalı.(yukarıda bahsedildi.).
Ortama inhibitör girmiş olabilir. Bu da aktivitenin gitmesine neden olabilir. Bunun yanı sıra ortamdaki aktivatörler veya kofaktörler istenmeden uzaklaştırılmış olabilir. Bu hususlara da dikkat edilmelidir.
Mümkün olduğu kadar çabuk bir şekilde saflaştırma işlemleri yürütülmelidir. Aksi durumda önlenemeyen inaktivasyondan dolayı yapılan çalışmalarda hatalar olacaktır.
BİYOLOJİ ÖDEV YARDIM
-
Mercanlar ve Mercan resifleri hakkında bilgi
-
Kulak Nedir? Kulağın Yapısı ve Görevleri Nelerdir?
-
Göz nedir ? Gözün görevleri nelerdir ? Canlılarda göz ve görme organı
-
Boğaz nedir ? Boğazın kısımları nelerdir ?
-
Omurga, columna vertebralis nedir ? Görevleri nelerdir ?
-
Doğal gübreler nelerdir
-
Kimyasal (yapay) gübreler nelerdir
-
Kortizol Nedir
-
Semantik Nedir ?
-
Karasal Ve Sucul Biyomların Özellikleri Nelerdir ?
-
Kaç çeşit biyom vardır
-
Bitki Ve Hayvanların Yeryüzündeki Dağılımını Etkileyen Faktörler Nelerdir?
-
Bitkisel dokular hakkında bilgi
-
Ekosistemde besin zinciri ve besin ağının önemi nedir ?
-
Genetik Algoritmalar