Biyologlar - Biyolojiye Gerçekçi Yaklaşım

Apoptoz’un Belirlenmesinde Kullanılan Morfolojik görüntüleme yöntemleri

---

1. Işık mikroskopu kullanımı:
a. Hematoksilen boyama: Morfolojik görüntüleme yöntemleri içinde en ucuz ve kolay olanı hematoksilen ile boyamadır. Hematoksilen ile boyanan preparatlar ışık mikroskobu ile incelenir. Hematoksilen boyama (HB) hem hücre kültürü çalışmalarında hem de doku boyamalarında kolaylıkla kullanılabilir. Apoptotik hücrelerin saptanmasında genellikle ilk metod olarak başlanması uygundur ve çeşitli açılardan (örn. ilk değerlendirme, maliyet) diğer metodlara karşı avantaj sağlar. Hematoksilen boyamada, hematoksilen boyası kromatini boyadığından apoptotik hücreler nukleus morfolojisine göre değerlendirilir. Apoptozise özgü değişiklikler iyi bir boyama yapılmışsa kolayca gözlenebilir. Fakat yine de deneyim gerektirmektedir. Çünkü bazı durumlarda mitotik hücreler ile apoptotik hücreler karıştırılabilir. Gözlenebilen değişiklikler şunlardır: hücre küçülmesi “cell shrinkage”, veya sitoplazmik küçülme “cytoplasmic shrinkage”, kromatinin kondanse olması “nuclear condensation” ve nukleus zarının periferisinde toplanması, nukleusun küçülmesi “pyknosis” veya parçalara bölünmesi “nuclear fragmentation”. Yukarıdaki fotoğrafda hemen hemen merkezi konumdaki iki hücrede nukleus fragmentasyonu görülmektedir.

b. Giemsa boyama: Giemsa ile boyamada hematoksilenle boyamada da olduğu gibi nukleus morfolojisi esas alınarak apoptotik hücreler tanınır. Sitoplazma sınırları hematoksilen boyamaya göre daha iyi seçilebilmekle birlikte hematoksilen boyamaya belirgin bir üstünlüğü yoktur.

2. Floresan mikroskopu / Lazerli konfokal mikroskop kullanımı: Floresan maddelerin (örn. Hoechst boyası, DAPI, propidium iyodür) kullanılmasıyla yapılan bir boyama şeklidir. Floresan boyalar DNA’ya bağlanabildiklerinden hücrenin kromatini dolayısıyla nukleusu görünür hale gelebilir. Floresan sistemler ışık mikroskopuna göre çok daha pahalıdır. Fakat, eğer hücre kültürü çalışmasında kullanılırlarsa, canlı hücre ile yaşayan hücrenin ayırımına olanak tanırlar. Oysa, hematoksilen ya da Giemsa boyamanın kullanıldığı örneklerde hücrelerin tamamı yöntemin prensibi gereği zaten ölmektedirler. Canlı ve ölü hücre ayrımını yapabilmek için, canlı veya ölü tüm hücreleri boyayabilen bir boya (örn. Hoechst boyası) ile sadece ölü hücreleri boyayabilen bir başka boya (örn. propidium iyodür) beraber kullanılır. Bu boyama yöntemindeki prensip şudur: Bu yöntemlerde canlılığın belirleyicisi, hücrenin plazma membranının (hücre zarının) intakt olup olmadığıdır. Membranı intakt olan (canlı) hücreler propidium iyodür gibi sadece membran bütünlüğü bozulmuş (ölü) hücreleri boyayan bir boya ile boyanmazlarken, Hoechst boyası gibi ölü veya canlı tüm hücrelere girebilen boyalar ise ortamdaki tüm hücreleri boyayarak ölü veya canlı hücre ayrımına olanak sağlarlar. Bu şekilde boyanan hücreler bir floresan mikroskopu ile tanınabilirler. Kuşkusuz, bu yöntemle hücrelerin ölü ya da canlı olduğu anlaşılabilir ama ölü hücrelerin apoptozisle veya nekrozisle ölüp ölmediklerinin ayrımı hematoksilen boyamada olduğu gibi nukleus morfolojisine bakılarak yapılır. Kromatin kondensasyonu veya nukleus fragmentasyonu olan hücreler apoptotik hücreler olduklarını düşündürür. Hücrelerin detaylı ayrımı aşağıdaki kriterlere göre yapılır:

- Nekrozisle ölen hücreler: Ölü oldukları belirlenen (Hem propidium iyodür hem de Hoechst boyası pozitif) hücrelerin nukleuslarında apoptotik değişiklikler görülmez. Nukleus paterninde büyük değişiklik yoktur. Nukleusun başlangıçda daha küçük olduğu gözlenebilir ama ileri evrelerde normale göre biraz daha büyümüş görülebilir. Boya yoğunluğu başlangıçda daha fazla olabilir ama ileri evrelerde yoğunluk apoptotik hücrelere göre daha az bulunabilir.

- Apoptozisle ölen hücreler: Apoptotik hücrelerde hücre zarı eğer sekonder nekrozis gelişmemişse intakt olduğundan propidium iyodür ile boyanmaz ama Hoechst boyası pozitifdir. Yani propidium iyodür negatif ve Hoechst boyası pozitif boyanırlar. Fakat apoptozise özgü nukleus morfolojisi bu hücrelerde tanı koydurucudur. Tipik nukleus fragmentasyonu en önemli bulgudur.

- Normal (canlı) hücreler: Propidium iyodür negatifdir. Hoechst boyası ile boyanırlar ve nukleus normaldir. Özetle: Nekrotik hücreler: Hoechst boyası (+) ve propidiyum iyodür (+); Apoptotik hücreler: Hoechst boyası (+), propidiyum iyodür (-) ve apoptotik morfoloji (+); Normal hücreler: Hoechst boyası (+), propidiyum iyodür (-) ve apoptotik morfoloji (-).

3. Elektron mikroskopu: Elektron mikroskopu ile değerlendirme apoptozisde en değerli yöntem (“gold standard”) olarak düşünülmektedir. Morfolojik değişikliklerin en doğru olarak gözlendiği bir yöntemdir. Üstelik subsellüler detaylar (örn. mitokondrinin durumu, hücre zarı ya da nukleus membranının bütünlüğünün bozulup bozulmadığı gibi) da incelenebilir. Yukarıdaki elektron mikroskopu çalışmalarında, üstteki resimde (A) nukleus fragmentasyonu net olarak izlenebilmektedir. Alttaki resimde (B), solda normal bir hücre görülmektedir. Sağdaki apoptotik hücrede, normal hücreyle kıyaslandığında sitoplazmik küçülme, kromatin kondansasyonu ve fragmentasyonu izlenebilmektedir.

4. Faz kontrast mikroskopu: Bu tür mikroskop sadece hücrelerin kültür ortamında, “flask” veya “plate”lerde büyütüldüğü çalışmalarda, hücreyi veya hücre topluluğunu incelemek amacıyla kullanılır. Ölen hücreler yapıştıkları “substratum”dan ayrılacakları için besiyer içinde yüzmeye başlarlar. Bu hücreler faz kontrast mikroskopu ile gözlenebilirler. Mitozise giden hücreler de faz kontrast mikroskopuyla gözlenebilirler fakat bu hücreler aynı zamanda apoptotik hücrelerin erken evredeki görüntüleri ile karışabilirler. O yüzden ayrımları hemen hemen imkansızdır. Gerek mitozisde gerekse apoptozisin erken evresinde hücreler üzerine yapıştıkları “substratum”a yayılmış halde değil, tam tersine yuvarlaklaşmış ve küçülmüş olarak görülürler. Faz kontrast mikroskopu ile apoptotik hücreler üzerinde gelişen cepcikler (“blebs”) izlenebilir.
Hücreler henüz “substratum”a yayılmış haldeler ise hücrelerin sitoplazmasında ortaya çıkan vakuoller de gözlenebilir. Ayrıca, bazı hücre tiplerinde “blister” olarak adlandırılan hücrenin sitoplazmasından dışarıya taşar gibi görülen bir veya birkaç tane büyük vakuoller de gözlenebilir. Bu vakuoller hücreden ayrılıp besiyer içinde yüzebilirler. İçleri boş küresel yapılar olarak gözükürler. Bu vakuoller olasılıkla bazı araştırmacıların hayalet hücre (“ghost cell”) olarak adlandırdıkları yapılardır. Hücre kültürü ortamında apoptozise giden hücrelerin başlangıçda hücre membranları intakt olmasına rağmen ileri dönemlerde sekonder nekrozis gelişir ve böylece membran bütünlükleri bozulur. Sekonder nekrozis aşamasına kadar olan süre içinde non-vital boyalar denen (örn. propidium iyodür) boyalarla boyanacak olurlarsa apoptozis başlamış olmasına rağmen hücreler bu boyalarla boyanmazlar. Çünkü membran bütünlüğü halen tamdır. Sekonder nekrozis geliştikten sonra membran bütünlüğü bozulur ve hücreler non-vital boyalarla boyanma özelliği kazanmaya başlarlar.
“Blister”lerin oluştuğu aşamada membran bütünlüğü halen tamdır ve bu aşamada nukleus morfolojisindeki değişiklikler floresan boyalarla gözlenebilir. Fakat bu dönem uzun sürmez dakikalar içinde membran bütünlüğü bozulur. Faz kontrast mikroskopunda hücreleri gözlemek için normalde boya kullanmaya gerek yoktur ama istenirse yukarıda belirtildiği gibi hem faz kontrast mikroskopisi hem de floresan mikroskopisi aynı anda kullanılabilir. Böylece, örneğin nukleusu renklendirilmiş ve belirgin bir şekilde ortaya konmuş hücrelerin faz kontrast mikroskopisi fotoğrafları elde edilebilir.

Kaynak:

http://biyokimya.uludag.edu.tr/apoptozis_ders_notu.pdf 

Dr. Engin ULUKAYA Biyokimya Anabilim Dal

---