BOYAMA YÖNTEMLERİNİN BİLİMSEL KONTROLU
Histolojik boyamanın kesin kimyasal reaksiyonlarla başarılabildiği gösterilmiştir, fakat daha az kesinlik kazanmış kimyasal ve fiziksel proceslerle başarılmaktadır. Bu; boyama yöntemlerinin çok sayıdaki farklı faktörlere göre oldukça değişeceği anlamına gelmektedir. Bu aynı zamanda geliştirilen boyama tekniklerinin çokluğunun nedenini ortaya koymaktadır. Fakat her histoloğun bu yöntemlerde başarısızlığa uğradığı olmuştur. Bunun nedenleri şunlar olabilir:
l-Dokuların reaktif olmaması,
2-Uygun olmayan fiksasyon,
3-Boyaların kompozisyonundaki ve çözünürlüğündeki farklılıklar,
4-Yetersiz olgunlaşma veya bozulma {boya solusyonunun),
5-Boyanın ve çeşme suyunun PH' sındaki veya ısısındaki değişmeler,
6-Birçok diğer faktör olabilir.
Boyamadaki bilimsel kesinliğin eksikliği, histoloğun en iyi sonuçları elde etmek için kendi yöntemlerini kontrol etmesi gerektiği anlamına gelmektedir. Eğer çeşme suyunun pH' sı veya yapısı değişirse veya iklimsel durumlar farklıysa, bir ülkede iyi çalışan bir yöntem diğer bir ülkede hatta aynı ülkenin bir başka bölümünde tatminkar olmayabilir. Bir boyama yönteminde verilen direktifler dikkatli olarak takip edilmelidir ancak değiştirilemez diye de düşünülmemelidir. Laboratuvar, özel doku elementleri, patolojik değişiklikler, bakteriler, metaller gibi maddeleri içerdiği bilinen dokuların kapatılmış boyanmamış parafin kesitlerin bir stoğunu bulundurmalıdır. Bunlar kontrol kesitler olarak kullanılmalıdır. İncelenecek kesitle aynı anda ve aynı yolla boyanmalıdır. Bu kontroller, glikojen veya asit-fast basiller gibi özel yapıların boyanmasındaki aksiliklerden uzak kalır ve sonradan dokunun glikojen veya asit fast basiller içerip içerrnediği mi yoksa tekniğin mi yetersiz olduğunu söylernek mümkün olamaz. Kontrol kesitine bir göz atmakla buna karar verilecektir. Her laboratuvar çalışanı bir tekniğin kontrol edilmiş varyasyonlarını yapma becerisinde olrnalıdır. Bir boyama yönteminin rastlantılara dayanan çok sayıdaki farklı şekilleri, şans eseri mükemmel sonuçlar verebilir fakat sonradan genellikle tekniği tekrar etmek mümkün değildir. Aynı doku bloğundan çok sayıda kesit alınmalı ve yöntemin her basamağındaki değişikliklerin bir serisi, teker teker ve her kesitte sadece bir değişiklik yapılarak yapılmalıdır. Tekniğin geri kalan bölümünü sabit tutarak, bu kesitlerle yöntemin hangi kısmında bu kesitlerin kusurlu olduğu ve nasıl düzeltilebileceği görülecektir. Ara sıra normal dokularda ve laboratuvardaki kontrol kesitlerde sezilebilir miktarda bulunrnayan nadir bir patolojik değişikliği veya yabancı bir maddeyi boyamak gerekir. Bu durumlarda bir suni doku bloğu incelenecek maddeyi içeren jelatinden yapılabilir veya materyel bir laboratuvar hayvanına enjekte edilebilir ve dokular kontrol kesitler olarak kullanılabilir.
HEMATOXYLİN-EOZİN BOYASI
Histolojik preparasyonlar için ençok kullanılan boyalar hemotaxylin ve eosin boyalarıdır. Buna kısaca H.E. boyası denir. Hemotoxylin bazik bir boya olarak kabul edilirse de kendisi bizzat boya değildir. Boya olarak tesir etmesi için zincirlerinden birinde bulunan guioid' in hematein' e okside olması lazımdır. Hemotaxylin hematein'e okside olması sulu bir solusyon içinde bir aydan fazla bir zamana ihtiyaç gösterir. Oksidasyon, sodium iodate veya mercuri choloride ilave etmekle hızlandırılabilir. Fakat hematein' in ileri bir oksidasyonunda solusyon boyanma yeteneğini kaybeder.
Hematein zayıf , anyon yüklü, kırmızımtrak sarı bir boyadır. İzoelektrik noktası takriben 6.5' tur. Zayıf bir boyadır. Fakat bir mordant ile kullanılırsa koyu ve devamlı bir boya olur. Mikroteknikten hemateinle mordant olarak kullanılan maddeler genellikle aluminum ve demir tuzları, aluminum ve demir şaplar. ( alum) dır. En çok kullanlan şaplar
Potasyum alum : K2S04Al2 (SO4)3 24 H2O
Ammonium alum : (NH4)2 SO4'A12 (SO4)324 H2O
Demir alum : (NH4)2SO4 Fe2(SO4)324 H20 dur.
Aliminum ile demirin verdiği renk morluğu birbirinden farklıdır. Aluminyum mavi-mor bir renk verir. Suda erir,dokuya temas ettikten sonra ne su ne de etil alkol onu tekrar çıkartabilir. Aluminyumla hematein, bazik boya gibi etki eder (yani katyonik bir boya vazifesi görür). Demirli hematein ise siyah veya lacivert renk verir , fakat etkisi birincisi kadar basit değildir. Rutin teknikte, kesitler önce mordantlanır sonra boya ile ( hematein) muamele edilir, fazla mordant solusyonda differansiye edilir. Bu şartlar altında hematein bazik boya olarak tesir eder.
Eosin: Eosin, fluorescein' in tetra broma türevidir. Zayıf asidik anyonik bir boyadır. Hemataxylin-Eosin boyası ile hücre ve doku elemanları aşağıda gösterildiği gibi boyanır.
Çekirdek Mavi,siyah ve koyu mavi
Sitoplazma Pembe
Eritrositler Kırmızı
Kas Kırmızı
Fibröz Doku Açık pembe
Kıkırdak Açıktan koyu maviye kadar renk tonlarında
Mükoz Mavimtrak ( metakromatik)
Kalsifiye Doku Koyu mavi
Protein çökelekleri Pembe
ödem sıvısı)
Bakteri toplulukları Koyu mavi
Çekirdeklerin mavi-siyah renkte boyanmasının nedeni polianyonik DNA konsantrasyonunun fazla olması ve bazik hematein-mortantla kuvvetli bir şekilde etkilenmesidir. Durum kıkırdakta da aynıdır. Yalnız burada anyonik glikozaminoglikan daha yüksek konsantrasyondadır. Sitoplazma, her ne kadar pembe olarak tarif edilirse de mikroskopta maviye çalar pembe tonda görülmektedir. Sitoplazmadaki RNA hematein-mortantla birleşerek bu rengi alır. Eğer RNA çoksa mavilik daha belirgindir. Aynı durum anyonik polisakkaritlerden zengin mucin salgılayan hücreler için de sözkonusudur. Böylece diğer subselüler ve doku elemanlarının kimyasal yapısını gözönüne alarak bunların değişik renk alış nedenlerini açıklıyabiliriz.
1-HEMATOKSİLEN BOYA ÇÖZELTİSİ
Harris' s Alum haematoxylen 5.0 gr
Absolu alkol 5 0 cc
Aliminyum amonyum sulfat 100 gr
Distile su 1000. 0 cc
Merkurik asi t ( oksi t ) 2.5 gr
Hematoksileni alkol içinde hafif ısı yardımıyla erit. Alumu ısı yardımıyla distile su içinde erit. Herbiri tamamen eridikten sonra iki solusyonu bir geniş erlenmayer içinde karıştır. Karışım süratle kaynar hale getir, ateşi söndür. Kabarcık1ar çıkarken merkurik oksiti yavaşca (azar azar) ilave et. Çözelti koyu mor renk alınca cam kabı soğuk su altına (dıştan) tutarak çözeltiyi soğut. Soğuyunca boyama için hazırdır. Fakat 2-3 gün kalsa daha olgunlaşır. Olgunlaşma, cam kabın ağzı gevşekce kapatılıp güneş ışığı alan bir yere bırakılarak sağlanır. Olgunlaşmış çözelti, koyu renkli şişelere alınıp, ağzı sıkıca kapatılarak karanlık yerlerde saklanır.
2-ERLİCH ASİT HEMATOKSİLENİ
Hemotoksilen 6.4 gr
Ammonium alimunyum sulfat 40 gr
Etil alkol 322 ml
Gliserol 322 ml
Distile su 322 m1
25C'de 6-8 hafta beklenilir. Hemen olgunlaştırmak için 0.64 gr sodyum iodat eklenir.
3-ERLICH HEMATOKSİLENİ
Hemotoksilen 4 gr
% 95 Alkol 200 cc
Distile su 200 cc
Gliserin 200 cc
Amonyum veya potasyum aluminyum 6 gr
Glacial asetik asit 20 cc
2 hafta veya daha fazla süre hava ve ışığa açık tuturak olgunlaştır. Hemen kullanmak istenirse 0.6 gr sodyum iodat eklenir.
4- %1 ‘lik ALKOLİK EOZİN
Eozin Y 10 g
Distile su 50 ml
Eozini distile suda erit, % 95’lik etil alkolden 940 ml ilave et. Bu eozin stok olarak kalır ve eşit miktarda % 95 etil alkol ilavesi ile kullan.
5-% 0.5 lik Sudaki EOZİN
Eozin Y 5 g
Distile su 1000 cc
Eozini suda erit. Koyu ton arzu edilirse her 100 cc’lik solusyon için 0.5 cc glacial asetik asit ilave edilir.
6-HARRİS ALUM HEMATOKSİLENİ
Hematoksilen 5 g
Absolu alkol 50 cc
Alkolde ısıtalarak eritilitr.
Amnium veya potasyum alum 100 g
Distile su 1000 cc
Suda ısıtarak alumu erit. Soğutulan 2 karışım birbirleri ile karıştırılıp tekrar süratle kaynayana kadar ısıtılır ve alev üzerinden alınır. Sonra yavaş yavaş mercury oksit ilave edilir ve tekrar ısıtılır. Menekşe rengini alır almaz soğuk su bulunan kap içersine oturtulur. Boya kullanılacağı zaman % 4 asetik asit glasiyal eklenir.
7-EOZİN
Eozin yellowish 1 g
Distile su 100 cc
Thymol 1 küçük kristal
8-ERLİCH HEMATOKSİLENİ
Hematoksilen 80 g
Alkol (% 95) 2400 cc
Potasyum alum (Alimunyum potasyum sulfat ) 240 g
Distile su 1200 cc
Glycerol 1200 cc
Glasiyal asetik asit 120 cc
1-Ksilol 30 dk.
2-Ksilol 30 dk.
3-Absolü Alkol Çalkalama
4-% 95’lik etil alkol Çalkalama
5-% 80’ lik alkol Çalkalama
6-% 70’ lik alkol Çalkalama
7-% 50’lik alkol Çalkalama
8-% 30’ luk alkol Çalkalama
9-Distile su Çalkalama
10-Hematoksilen 5-8 dk
11-Akarsu
12-Asit-Alkol Daldırıp-çıkarma
13-Akarsu
14-Amonyak 30 saniye
15-Akarsu
16-Eozin 3-5 dk
17-% 30’ luk alkol Çalkalama
18-% 50’lik alkol Çalkalama
19-% 70’lik alkol Çalkalama
20-% 80’ lik alkol Çalkalama
21-% 95’lik etil alkol Çalkalama
22-% 100’lük etil alkol Çalkalama
23-% 100’lük etil alkol Çalkalama
24-Ksilol
25-Ksilol (1 gece bekletilirse iyi olur)
Hematoksileni alkolde çözün. Alumu sıcak su içinde çözüp gliserolü ekleyin, soğumaya bırakın. Azar azar aluma hematoksileni ekleyerek karıştırın. Bu solusyon temiz bir kapta olgunlaşmaya bırakılır. Ağzı hafifçe kapatılır. Olgunlaşma 6-8 hafta sürer ve solusyon boyama özelliğini yıllarca korur. Hematoksilende 45 dk. boyanır.
9- WEİGERT HEMATOKSİLENİ
Solusyon A: Hematoksilen 1 g
Alkol 100 cc
4 hafta olgunlaştırılır.
Solusyon B:
% 30 luk ferrik klorür-sulu 4 cc
Konsantre HCl 1 cc
Solusyon A ve B den eşit miktarda karıştırılıp 30 dakika içinde kullanılır ( 15-20 dak)
10-HEİDENHEİN HEMATOKSİLENİ
Demir Alum Çözeltisinin Hazırlanışı
Ammonium ferric sülfat 5 g
Distile su 100 cc
Hematoksilen Çözeltisinin Hazırlanışı
Hematoksilen 0.5 g
Absolü alkol 10 cc
Distile Su 90 cc 4 hafta olgunlaşmaya bırakın
Uygulama
1-Kesitler suya indirilir
2-Demir alumda 30 dakika –24 saat arasında bırakılır
3-Akar suda çalkalama
4-Heidenhein hematoksilende 30 dakika –24 saat arasında boyanır.
5-Suda çalkalayın
6-Demir alumda 1-30 dk. mikroskopla kontrol edilerek differansiye edilir.
7-En az 10 dk. akar suda yıka
8-Karşıt boyalar Van Gieson ve modifiye şekilleridir.
11-CARAZZİ HEMATOKSİLENİ
Hematoksilen 0.5 g
Glyserol 100 cc
Aluminyum potasyum sulfat 25 g
Distile su 400 cc
Potasyum iodat 0.1 g
Hematoksileni gliserol ile karıştırın. Isı kullanmadan distile suda potasyum alumu çözün. Çözünme uzun zaman alabilir. Hematoksilene alumu karıştırarak yavaş yavaş ekleyin. 10 cc suda potasyum iodatı iyice karıştırarak çözün. 4-6 ay boyunca solusyon boyanma özelliğini korur.
HEMATOKSİLEN - EOZİN BOYA TEKNİĞİ
1- Ksilol 30 Dakika
2- Ksilol 30 Dakika
3- Absolü Alkol Çalkalama % 100 Alkol
4- %95'lik Alkol Çalkalama
5- %80'lik Alkol Çalkalama
6- %70 'lik Alkol Çalkalama
7-%50' lik Alkol Çalkalama
8-%30' luk Alkol Çalkalama
9- Dis ile su Çalkalama
10-Hematoksilen Çalkalama
11- Akarsu Çalkalama
12- Asit- Alkol Daldırıp çıkarma
13- Akarsu Çalkalama
14- Amonyak 30 saniye çalkalama
15- Akarsu Çalkalama
16- Eozin 3-5 dakika
Suda çalkalama
17- %30 'luk Alkol Çalkalama
18- %50'lik Alkol Çalkalama
19- %70'lik Alkol Çalkalama
20- %80'lik Alkol Çalkalama
21-%95'lik Alkol Çalkalama
22-Absolü Alkol (%100 Alkol) Çalkalama
23- Ksilol 30 dakika
24- Ksilol (Bir gece bekletilirse daha iyi şeffaflanır.)
Asit-Alkolün Hazırlanışı
% 80’lik etil alkol 500 cc
Hidroklorik asit 5 cc
Amonyağın Hazırlanışı
Distile su 500 cc
Amonyak 5cc
8-KAPATMA (Mounting)
Boyanan kesitler 1 damla Kanada balzamı veya entellan damlatarak lamel kapatarak kurumaya bırakılır. Bu maddeler hem mikroskopta kolay incelenmeyi sağlar hem de boyanmış kesitlerin yıllarca korunmasını sağlar
RUTİN EL TAKİBİ ( 3-5mm kalınlığındaki bloklar için)
1- Tespit
2- Eğer gerekli ise suda yıkamak
3-%70'lik alkolde gün boyunca (3-8 saat)
4- % 90' lık alkolde bir gece (16 saat)
5- Absolu alkol I de iki saat
6- Absolu alkol II de üç saat
7- Absolu alkol III de üç saat
8- Toluene veya kloroform da gece boyunca ( 16 saat )
9- Her birinde birer saat olmak üzere üç kez erimiş parafinden geçirmek}:
10-Parafine gömmek
HIZLI EL TAKİBİ ( 3 mm den kalın olmayan bloklar için )
1- Carnoy- fiksatıtifinde 30- 60 dakika tespit
2- Absolu alkol I de 30dk
3- Absolu alkol I de 30 dk
4- Absolu alkol III de 30 dk
5- Ksilen veya. toluenle 15- 30 dk ( şeffaflanıncaya kadar )
6- Vakum fırınında herbirinden yirmişer dk. olmak üzere üç kez erimiş parafinden
geçirme
7- Gömme
RUTİN OTOMATİK TAKİP ( 3-5 mm kalnlığındaki bloklar için )
1- %70' lik akolde üç saat
2-% 90' lik alkolde üç saat
3- Absolu alkolde ( I'de ) 1 saat
4- Absolu II'de 1 saat
5- Absolu alkol III ' de 2 saat
6- Absolu alkol IV de 2 saat
7- Toluen I' de 1.5 saat
8- Toluen II' de 2.5 saat
9- Erimiş parafin I' de 3 saat
10- Erimiş parafinde II ' de 3 saat
11-Gömme
Toplam: 22 saat
48 SAATLİK OTOMATİK TAKİP (3-5 mm kalınlığındaki bloklar için )
1-% 10’ luk formal salin 4 saat
2-% 10’ luk formal salin 4 saat
3-% 70 lik alkol 4 saat
4-% 90’lık alkol 4 saat
5- Absolu alkolde I'de 4 saat
6- Absolu II'de 4 saat
7- Absolu alkol III ' de 4 saat
8- Absolu alkol IV de 4 saat
9-Kloroform I 4 saat
10-Kloroform II 4 saat
11-Erimiş parafin I 4 saat
12-Erimiş parafin II 4 saat
EL İLE HIZLI TAKİP
1-Bouin fiksatifi ile tespit 6-7 saat
2-Çeşme suyunda yıkama
3-% 70’lik alkol 60 derecelik etüvde 1 gece
4-% 96’ lık alkol 60 derecelik etüvde 1 saat
5-% 96’ lık alkol 60 derecelik etüvde 1 saat
6- Absolu alkolde ( I'de ) 60 derecelik etüvde 1 saat
7- Absolu II'de 60 derecelik etüvde 1 saat
8- Ksilol 60 derecelik etüvde 1 saat
9-Ksilol 60 derecelik etüvde 1 saat
10-Parafin 60 derecelik etüvde 1 saat
11-Parafin 60 derecelik etüvde 1 saat
12-Gömme
EL İLE HIZLI TAKİP
1-Tamponlanmış nötral formalin ile tespit
2- %50 ‘lik alkol 60 derecelik etüvde 30 dakika
3-% 70’lik alkol 60 derecelik etüvde 30 dakika
4-% 80’lik alkol 60 derecelik etüvde 30 dakika
5-% 96’ lık alkol 60 derecelik etüvde 1 saat
6-% 96’ lık alkol 60 derecelik etüvde 1 saat
7- Absolu alkol I 60 derecelik etüvde 1 saat
8- Absolu II 60 derecelik etüvde 1 saat
9- Ksilol 60 derecelik etüvde 1 saat
10-Ksilol 60 derecelik etüvde 1 saat
11-Parafin 60 derecelik etüvde 1 saat
12-Parafin 60 derecelik etüvde 1 saat
13-Gömme
Histoloji
-
Endosülfan ve okratoksin-A’nın birlikte sıçanlarda toksisitesi: histopatolojik değişiklikleri
-
Histoloji Pdf Ders Notları
-
DEKALSİFİYE EDİLMEMİŞ KESİTLERİN HAZIRLANIŞI
-
DEKALSİFİKASYONU TEST ETMEK
-
KELATLAMA AJANLARI
-
ELEKTROLİTİK DEKALSİFİKASYON
-
ASİT DEKALSİFİKASYON SIVILARI
-
Histopatoloji nedir ?
-
KEMİK DOKUSU VE DEKALSİFİKASYON
-
MSS’DE DEJENERE MİYELİNİN GÖSTERİMİ
-
MARKSCHE’DEN BOYASI (Spielmayer, Benda)
-
MSS‘DE MİYELİNİN GÖSTERİMİ
-
KARIŞIK OLAN TEKNİK
-
BİELSCHOWSKY TEKNİĞİ
-
GÜMÜŞ ÇÖKTÜRME YÖNTEMLERİ