DEKALSİFİYE EDİLMEMİŞ KESİTLERİN HAZIRLANIŞI

Dekalsifiye edilmemiş kemik kesitlerine 2 temel amaç için gereksinim vardır.
1-Normal kemik yapısını ve kemik mineralinin dağılımını çalışmak için
2-Osteomalazi ve rickets gibi osteoid dokuda bir artışla sonuçlanan normal kalsifikasyon sürecinin bozulduğu metabolik kemik hastalıklarının teşhisi için
Rutin olarak dekalsifiye edilmiş, parafine gömülmüş kemik kesitlerindeki osteoidin differansiyel boyaması yeterli derecede güvenilir değildir veya teşhis için doğru değildir. Dekalsifiye edilmemiş kemik kesitleri aynı zamanda kemik büyüme merkezlerine lokalize olan tetrasiklin ve ilişkili antibiyotikle¬rin araştırılmasında da kullanılmaktadır ve kesitlerde floresans mikroskopi ile gorülebilirler. Dekalsifiye edilmemiş kemiğin haraplanmamış kesitlerinin hazırlan¬masındaki mevcut olan teknik zorluklar, bu amaç için birçok yöntem açıklanmasına rağmen henüz tam olarak aşılamamıştır. Bunlar 3 grupta düşünülebilir:
1-Resine gömülmüş veya gömülmemiş kemiğin testere ile kesilmesi ve bilenerek öğütülmesi,
2-Selüloz nitratparafin çiftli gömme materyeline gömülmüş materyalin sellofan bantlı veya selofan bantsız kesit alınması,
3-Ağır bir mikrotom ve bıçağı kullanarak resine gömülmüş kemiğin kesitinin alınması,
İkinci ve üçüncü yöntemler sadece küçük süngerimsi kemik parçaları için uygulanabilir.

TESTERELEME VE BİLEME YÖNTEMİ

Bu prosedürlerin bir kombinasyonu, erişkin uzun kemiğinin veya bir dişin transvers kesiti gibi dens kortikal kemik kesitlerinin hazırlanması için gereklidir. En basit formunda, yöntem ince bir testere ile kemikten ince bir dilim kesilmesi ve ardından bir bileme taşı veya % 70 lik alkol veya suyu lubrikant olarak kullanarak silikon carbide cilası ile önceden keskinleştirilmiş (pürüzsüzleştirilmiş cam plaka tabakaları arasında elle bilemekten ibarettir. Kesit daha sonra yıkanır, kurutulur ve lama aktarılarak kapatılır.
Daha emekli işlemlerde ise diş ve kemik kesitleri, mühendislerin torna-freze makinalarıyla veya bir mekaniksel bileme aygıtı ile sentetik resine gömülmüş veya gömülmemiş bloklardan hazırlanır. İstenilen özel aletlerden daha önemlisi kesitin final kalınlığının preperasyon sırasın¬da 10 katı (ve bazen daha fazla) kaybolarak israf olmasıdır. Bununla be¬raber, böylesi bir yöntemin uygulanması (günümüzde) dekalsifiye edilmemiş kompakt kemiğin ince kesitlerinin ve olgun dişlerin preperasyonları için gereklidir.

SELOFAN BANT YÖNTEMİ

Bu yöntem laboratuvarlarda daha gönül rahatlığı ile uygulanabilir ve herhangibir özel aygıta gereksinim de yoktur. Sadece spongioz kemiğin küçük parçaları için (10x5x3 mm) için uygundur ve sıklıkla ilyak krista biyopsileri için histopatolojide kullanılmaktadır. Yöntemde transparan bir selofan bant şeriti, dekalsifiye edilmemiş kemiğin kırılmasını ve bükülmesini önlemek için parafin bloğun yüzeyine yapıştırılır. Selofan bant kesitten, lama monte ettikten sonra ve boyamadan önce uzaklaştırılır. Plastik selofan bant yerine zamklı kağıt da kullanılabilir.
1-Selofan Bant Yöntemi ( Ball tarafından modifiye edilmiş-1957 )
% 10'luk nötral formal-salin ile 12-24 saat yapılır,
%70, % 90 ve üç değişim absolu alkol ile dehidre edilir.
Metil benzoat ile hazırlanmış % 3'lük LVN 'de herbirinde 4 saat olmak üzere iki değişimi ile impregne edilir.
Metil benzoat ile % 20 ‘lik LVN'de bir gece bırakılır.
Dokunun etrafından selüloz nitratın fazlası uzaklaştırılır ve 3 değişim toluende herbirinde ikişer saat bırakılır.
Parafin banyosuna (560 C) aktarılır, iki değişim yapılır ve herbirinde 1 saat tutulur. Üçüncü parafinde ise 1 gece bırakılır. Ertesi sabah taze parafinle gömülür.
Blok ağır bir mikrotoma dikkatli olarak yerleştirin ve trim bıçağı ile yüzeyini açın. Trim bıçağını çıkarıp çok keskin, D-profil tipindeki bir bıçağı yerleştirin. Mikrotomu 8 µm ye ayarlayın. Selofan bantın dar olan yapışkan kısmının 25 mm lik bölümünü bloğun üzerine spesimenin ilerisine doğru uygulayın. Selofan bantın bu serbest ucunun kaldırılması bıçağın ağzını temizler, kesit kıpırdatmadan fakat kuvvetli bir hareketle alınır. Selofan bant bloğa tekrar uygulanır ve daha sonraki kesit alınır ve böyle böyle tekrarlanarak kesitler alınır. Selofan bantın bir kısmına yapışmış olan kesitler selofan bant şeritinden bir makas yardımıyla kesilir ve yumur¬ta akı sürülmüş lam üzerine sıkıca yapıştırılır. Kesitlerin lama yapış¬ması için 20-30 dakika sıcak plaka üzerinde tutulur. Selofan bantın yapışkansız kısmı suda çözünür ve ıslak kurutma kağıt şeritleri ile kısa bir zaman sonra uzaklaştırılır. Yapışkan kısmı ise daha zor uzaklaştırılır ve lamın ılık benzen veya toluen veya bunların 60 0C de kapalı şişedeki karışımı ile batırıp ıslatmaya gerek¬sinimi vardır. Yapışkan kesitten çözünüp ayrıldığında kesit, boyama için hazırdır fakat ince bir selüloz nitrat filmi ile kaplanması ayrılmaya karşı bir önlem olarak avantaj olabilir.
Açıklamalar:
1-Bant kullanımı çiftli gömme yapılmış materyele bir avantaj sağlamaz.
2-Dekalsifiye edilmemiş kemik kesitlerinin incelenmesi için özellikle yararlıdır. Bunlar: a-Polarize ışık ile inceleme için boyanmamış bir kesit
b-H&E ile boyanmış kesit,
c- Kalsiyumu göster¬mek için von Kossa boyası
Resine Gömülmüş Dekalsifiye Edilmemiş Kemikten Kesit Alma: Kemik trabeküllerinin bazı çatlaklarının ortaya çıkmasına rağmen parafine gömmeye nazaran doku desteği ve korunması daha iyidir. Aşağıda açıklanan basit metil metaerylat gömme tekniği güvenilirdir ve başarıyla geniş bir kullanıma sahiptir. Yöntem, mikrotom yönteminden başka testereleme ve bileme yapılacak dokular içinde uygulanabilir. % 10' luk nötral formal-salin ile en az 24 saat, tercihan ise 48 saat tespit edilir.

#dekalsifiye #edilmemiş #kesitlerin #hazirlanişi