RNA İzolasyonu
Yöntemin prensibi
Yöntem doku ya da hücrelerin lizis solüsyonu ile parçalanıp fenol yardımıyla RNA’nın ekstrakte edilmesine dayanır. Orijinal hali Chomczynski ve Sacchi tarafından 1987’de tanımlanan protokolün kısaltılmış, modifiye formudur. Yöntem kısaltılmış olsa da günümüzde var olan kolon yardımıyla izolasyon yapan kitlere göre RNA’nın saflığı daha düşüktür.
Malzemeler
1. Guanidin isotiyosiyanat
2. 1 M sodyum sitrat, pH 7.0
3. SDS
4. β-merkaptoetanol
5. 2 M sodyum asetat, pH 4 .0
6. Absolü etanol
7. İzopropanol
8. 70% etanol
9. Solusyon D
- 25 mM sodyum sitrat, pH 7.0
- %0.5 SDS
- 100 mM β-merkaptoetanol
- 4 M Guanidin izotiyosiyanat
Uygulama Basamakları:
1. Doku hızlıca 4 °C’de D solüsyonunda (50 mg doku için 500 μL) lize edilir.
2. 0.1 hacim 2 M sodyum asetat ( pH 4.0) tüpe eklenir, karıştırılır.
3. 1 hacim fenol (su ile doyurulmuş) tüpe eklenir, karıştırılır.
4. 0.2 hacim kloroform: izoamil alkol (49:1) tüpe eklenir, iyice vortekslenir.
5. 15 dakika buz üzerinde bekletilir.
6. 12,000 g’de 15 dakika 4°C’de santrifüj edilir.
7. Üst fazında RNA bulunur. Bu bölüm yeni bir ependorf tüpüne aktarılır. Eğer RNA’nın saflığı arttırılmak istenirse 2-7 .basamaklar tekrar edilir.
8. RNA’nın çöktürülmesi için eşit hacimde izopropanol eklenir. -20’de en az 1 saat bekletilir.
9. 12,000 g’de 15 dakika 4°C’de santrifüj edilerek RNA çöktürülür.
10. %70’lik alkol ile RNA yıkanır. Bunun için 500 μL etanol eklenir. Ependorf tüpü altüstedilir.
11. 12,000 g’de 5 dakika 4°C’de santrifüj edilerek RNA çöktürülür.
12. Üst fazı atılarak RNA havada kurutulur.
13. RNA suda çözülür. Çözülmesini kolaylaştırmak için 65 oC’de 10 dakika tutulur.
12.Elde edilen RNA dan 1/25 -1/40 dilüsyon hazırlanır. A280 / A260 oranı ölçülür (oran >1.5 olmalıdır). 280 nm’deki absorbans önce 40 ile, sonra dilüsyon faktörü ile çarpılır. Sonuç RNA konsantrasyonunu verir.
Kaynaklar
1. Chomczynski, P. and Sacchi, N., 1987, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction, Anal. Biochem. 162, 156-159.
2. McPherson M.J, Quirke P, Taylor G.R (1991). PCR A practical Approach. Oxford University Pres Inc, New York.
3. Birnboim, H.C., 1988, Rapid extraction of high molecular weight RNA from cultured cells and granulocytes for Northern analysis, Nucl. Acids Res. 16, 1487-1497.
Genetik
-
İnsanlarda Kaç Kromozom Vardır?
-
Sık görülen mikrodelesyon sendromları nelerdir?
-
Bilim insanları kromozomları nasıl inceler?
-
Arkea'da Kromozomlar ve DNA Replikasyonu
-
DNA Onarım Mekanizmaları Nelerdir?
-
DNA hasarına neden olan etkenler nelerdir?
-
XYY Süper Erkek Sendromu - JACOB’S, Sendromu
-
Bitki doku kültürü çalışmaları ile haploid bitkiler elde edilebilir
-
Gram pozitif bakterilerden genomik DNA izolasyon protokolü
-
E. coli bakterisinden genomik DNA izolasyon protokolü
-
DNA’nın Keşfi
-
İnsan Genom Projesi Nedir ? Amaçları Nelerdir ?
-
Genomik mikrodizilimlerle ikilenme teşhisi yöntemi
-
Gen duplikasyonu ve amplifikasyonu nedir?
-
DNA ile RNA Arasndaki Farklar ve Benzerlikler Nelerdir