Lipit Ekstraksiyonu ve Kolesterol Tayini

Deneyin prensibi: Yumurta sarısı, süt, tereyağı ve cevizden ekstrakte edilen lipitlerdeki kolesterol miktarının Liebermann yöntemi ile belirlenmesidir.

Deneyin yapılışı:

I. aşama:

a) Yumurta sarısı, süt ve tereyağından lipit ekstraksiyonu

(1) Üç tane deney tüpü alınır ve her birine ilgili örneklerden 0.8 g ilave edilir.

(2) 8 mL kloroform/ metanol (2:1) (v/v) karışımı eklenir ve vorteks ile kuvvetle karıştırılırlar.

(3) 15 dakika 4000 rpm’de santrifüjlenir.

(4) Sıvı kısımların her biri yeni deney tüplerine alınır.

(5) Deney tüpünlerindeki kloroform/ metanol ekstraktına çözelti hacminin yaklaşık 1/5’i kadar %0.02’lik CaCl2 çözeltisi ilave edilir.

(6) Tüp vortekslenir ve fazların ayrılması için beklendikten sonra üst faz pastör pipeti yardımıyla dikkatle uzaklaştırılır.

(7) Alt faza çözelti ile aynı hacimde kloroform/ metanol/ su (2:50:50) eklenir.

(8) Tüpler vortekslenir ve fazların ayrılması için beklendikten sonra üst faz pastör pipeti yardımıyla dikkatle uzaklaştırılır.

(9) Alt fazın hacmi tayin edilir ve deneyin ikinci aşamasına geçilir.

b) Cevizden lipit ekstraksiyonu

(1) 0.8 g ceviz küçük küçük doğranıp 4 mL kloroform / metanol (2:1) (v/v) karışımı içeren havana konulur ve iyi bir şekilde öğütme işlemi yapılır.

(2) Havanın içeriği bir test tüpüne aktarılır. Havandaki kalıntılar 4 mL daha kloroform / metanol (2:1) (v/v) karışımı ile alınıp, deney tüpüne aktarılır.

(3) Tüpün ağzı kapatılır ve 50°C sıcaklıktaki su banyosunda 10 dk beklenir.

(4) 15 dakika 4000 rpm’de santrifüjlenir.

(5) Sıvı kısım yeni deney tüpüne alınır.

(6) Deney tüpündeki çözeltiye hacminin 1/5’i kadar %0,02’lik CaCl2 çözeltisi ilave edilir.

(7) Tüp vortekslenir ve fazların ayrılması için beklendikten sonra üst faz pastör pipeti yardımıyla dikkatle uzaklaştırılır.

(8) Alt faza çözelti ile aynı hacimde kloroform/ metanol/ su (2:50:50) eklenir.

(9) Tüp vortekslenir ve fazların ayrılması için beklendikten sonra üst faz pastör pipeti yardımıyla dikkatle uzaklaştırılır.

(10) Alt fazın hacmi tayin edilir ve deneyin ikinci aşamasına geçilir.

II. aşama:

I.aşamada elde edilen örnek çözeltilerindeki kolesterol miktarını belirlemek için aşağıdaki tabloya göre ilaveler yapıldıktan sonra 550 nm’de absorbans ölçümü yapılır.

Çözeltiler

Liebermann reaktifi: Buz banyosu içindeki bir beherdeki 60 mL asetik anhidrit üzerine sürekli karıştırılarak yavaş yavaş 10 mL derişik sülfürik asit ilave edilir. Daha sonra 30 mL asetik asit ve 0.6 g susuz sodyum sülfat eklenir. Reaktif 1-2 hafta saklanabilir.

%0.02 CaCl2 : 0.02 g CaCl2 / 100 mL su

10 mM kolesterol standardı: 0.191 g kolesterol 50 mL kloroform / metanol (1:1)

5 mM kolesterol standardı: 10 mM kolesterol standardından 10 mL alınır üzerine 10 mL kloroform / metanol (1:1) ilave edilir.

2.5 mM kolesterol standardı: 5 mM kolesterol standardından 10 mL alınır üzerine 10 mL kloroform / metanol (1:1) ilave edilir.

KAYNAKLAR

(1) www.mustafaaltinisik.org.uk

(2) www.firat.edu.tr

(3) www.saglikpark.com

(4) www.patienthealth.com

(5) http://chienlab.wikispaces.com

(6) Prof. Dr. Fahrünnisa Pamuk, Biyokimya Kitabı

(7) Marmara Üniversitesi Biyokimya II Laboratuar Föyü

(8) https://acikders.ankara.edu.tr/pluginfile.php/4491/mod_resource/content/0/8.%20Hafta.pdf

#Liebermann # Kolesterol Tayini